【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物工程，尤其涉及一种基于多孔微球的益生菌制剂及其制备方法和应用。
技术介绍
1、益生菌是指通过定植在人体内产生益处从而有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物群。其在促进营养物质的消化吸收、提高机体免疫力、抑制肠道炎症等方面具有巨大的应用价值。然而，益生菌制剂不仅在加工贮藏过程中会受到湿度、温度、ph值、氧气等外环境因素影响，而且在益生菌制剂进入消化系统经过胃液、胃蛋白酶、胰蛋白酶和胆盐类物质到达定植位置发挥作用时，也会受到体内环境影响导致活性损失。根据粮食及农业组织和世界卫生组织(fao-who)的规定，达到预期效果所需的最低益生菌数量应为107cfu/g。
2、益生菌制剂的制备能够保护益生菌免受外部环境的影响，从而延长保存期限、降低保藏条件、提高其存活率和功效，更便于使用与携带。冷冻干燥技术被广泛地应用于益生菌制剂的生产，相比于其他几种技术，冷冻干燥的加工条件更为温和，但是在低温冷冻过程中由于细胞外冰晶的形成和渗透压增加将导致细胞结构组织的损伤，仍然会发生一定程度的细胞失活。
3、微球是一种具有微米级尺寸的颗粒物，通常由聚合物或无机材料构成，具有较高的密度和表面积。目前微球主要被应用在吸附、药物分子承载注射以及固定化酶等方面，如cn108715833b公开了一种壳聚糖基微球制备方法，可应用于包埋药物分子并提高包埋率以及活性保持率。cn101708463b公开了一种高磁性负载导电高分子微球的制备方法可应用于重金属离子的吸附，性质稳定且吸附速度快。
4、虽然微球已经有
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种基于多孔微球的益生菌制剂及其制备方法和应用。本专利技术所述的方法通过单宁酸-ca2+络合修饰微球，将微球与益生菌共培养、填充式培养得到高菌浓度的混合物，通过单宁酸与蛋白质的相互作用修饰耐酸性生物材料粘蛋白，最后包裹冷冻保护剂脱脂奶粉。该益生菌制剂不仅可以减少益生菌在消化系统中的失活，并且会由于微球的加入使得细胞集中分布产生集群效应以增强抗逆性。
2、为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
3、一种基于多孔微球的益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
4、(1)将多孔微球与单宁酸-ca2+溶液混合得到修饰后微球；
5、(2)将益生菌接种至含有所述修饰后微球的发酵培养基中进行黏附共培养，得到第一发酵液，更换新鲜发酵培养基，进行填充式培养，得到第二发酵液；
6、(3)将所述的第二发酵液离心取沉淀，先后加入粘蛋白溶液和脱脂奶粉溶液混合，即得益生菌制剂；
7、其中，步骤(1)中，所述多孔微球为天然高分子基、无机化合物基或合成聚合物基多孔微球中的任意一种或几种组合。
8、其中，步骤(1)中，所述多孔微球的尺寸为10～60μm，孔洞结构口径大小为3～10μm，添加量为10～50g/l。优选地，多孔微球的尺寸为20～50μm，孔洞结构口径大小为5～10μm，添加量为36～50g/l。进一步优选地，所述的多孔微球的制备方法详见中国专利cn103374143a。
9、其中，步骤(1)中，所述单宁酸-ca2+溶液，将单宁酸溶液和氯化钙溶液按体积比为(1～5):(1～5)混合即得；优选地，所述的氯化钙为无水氯化钙。所述的体积比为4:1。
10、优选地，所述单宁酸溶液，溶剂为tris-hcl缓冲液，ph为5.0～10.0，浓度为1～10g/l；所述的氯化钙溶液，溶剂为tris-hcl缓冲液，ph为5.0～10.0，浓度为1～10g/l。进一步优选地，所述的单宁酸溶液，溶剂为tris-hcl缓冲液，ph为7.4，浓度为5g/l；所述的氯化钙溶液，溶剂为tris-hcl缓冲液，ph为7.4，浓度为5g/l。
11、其中，步骤(1)中，所述的混合时间为3～10h。优选为室温搅拌4h。
12、其中，步骤(2)中，所述的益生菌包括大肠杆菌、乳酸菌或枯草芽孢杆菌中的任意一种或几种组合。优选地，所述的益生菌以益生菌种子液的形式接种至含有所述修饰后微球的发酵培养基，接种后益生菌的初始od600值为0.1。
13、其中，步骤(2)中，所述修饰后多孔微球的添加量以每ml发酵培养基中添加0.01～0.05g计；优选地，每ml发酵培养基中添加0.04g修饰后微球。
14、所述黏附共培养时间为8～18h，温度为30～37℃；优选地，12～16h，35～37℃，120～250rpm。
15、所述填充式培养时间为12～24h，温度为30～37℃；优选地，18～24h，35～37℃，120～250rpm。
16、优选地，步骤(2)中，所述的共培养得到的第一发酵液中益生菌浓度为104～106cfu/ml；所述的更换新鲜发酵培养基的方法为：将第一发酵液静置沉淀，去除上层游离菌液，补充新鲜发酵培养基。更优选地，所述的静置沉淀时间为为1～5min。所述的填充式培养为益生菌通过共培养黏附于修饰后多孔微球内壁及表面后再进行更换新鲜发酵培养基使黏附于微球的益生菌大量增殖，提高浓度；
17、其中，步骤(3)中，所述的粘蛋白溶液，为粘蛋白的pbs溶液，其浓度为1～5g/l；所述的粘蛋白的添加质量为步骤(2)所述的修饰后多孔微球质量的1％～10％；优选地，黏蛋白溶液的浓度为2g/l，所述的粘蛋白的添加质量为步骤(2)所述的修饰后多孔微球质量的5％。
18、所述的脱脂奶粉溶液，为脱脂奶粉水溶液，其浓度为5～15g/l；所述的脱脂奶粉的添加质量为步骤(2)所述的修饰后多孔微球质量的10％～50％；优选地，脱脂奶粉溶液浓度为10g/l；所述的脱脂奶粉的添加质量为步骤(2)所述的修饰后多孔微球质量的15％～30％。
19、所述的混合时间为0.5～6h。优选地，室温下混合1～3h。
20、优选地，步骤(3)中，将所述的第二发酵液离心取沉淀，先后加入粘蛋白溶液和脱脂奶粉溶液混合，具体为：第二发酵液离心取沉淀后用生理盐水洗涤1～2次，再先加入粘蛋白溶液重悬后，搅拌混合得到第一重悬物，用生理盐水洗涤1～3次后再用脱脂奶粉溶液重悬、搅拌混合得到第二重悬物，经生理盐水洗涤1～3次、冷冻干燥即得益生菌制剂。所述的冷冻干燥，具体为先在-20℃条件下预冷冻24h，然后在-80℃下冷冻8～16h。
21、第二方面，本专利技术提供了第一方面所述的制备方法制备得到的益生菌制剂。
22、其中，所述的益生菌制剂中益生菌浓度为1013～1015cfu/g。
23、第三方面，本专利技术提供了第二方面所述的益生菌制剂在制备肠本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于多孔微球的益生菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述多孔微球为天然高分子基、无机化合物基或合成聚合物基多孔微球中的任意一种或几种组合。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述多孔微球的直径为10～60μm，孔洞结构口径大小为3～10μm，添加量为10～50g/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述单宁酸-Ca2+溶液，将单宁酸溶液和氯化钙溶液按体积比为(1～5):(1～5)混合即得；
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的混合时间为3～10h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的益生菌包括大肠杆菌、乳酸菌或枯草芽孢杆菌中的任意一种或几种组合。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述修饰后多孔微球的添加量以每mL发酵培养基中添加0.01～0.05g计；
8.根据权利要求1所述
9.根据权利要求1～8中任意一项所述的制备方法制备得到的益生菌制剂。
10.权利要求9所述的益生菌制剂在制备肠道药物或益生菌饮品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于多孔微球的益生菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述多孔微球为天然高分子基、无机化合物基或合成聚合物基多孔微球中的任意一种或几种组合。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述多孔微球的直径为10～60μm，孔洞结构口径大小为3～10μm，添加量为10～50g/l。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述单宁酸-ca2+溶液，将单宁酸溶液和氯化钙溶液按体积比为(1～5):(1～5)混合即得；
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的混合时间为3～10...
【专利技术属性】
技术研发人员：庄伟，张金明，张吉行，应汉杰，吴菁岚，杨朋朋，陈勇，柳东，沈涛，朱晨杰，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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