荧光示踪多功能脱色的脱色希瓦氏工程菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种荧光示踪多功能脱色的脱色希瓦氏工程菌及其构建方法，旨在提供一种对偶氮、蒽醌和三苯基甲烷三大类染料都具有高效脱色能力，并且具有荧光示踪功能的基因工程菌。本发明专利技术的技术方案是将外源融合基因ＳＰｒｔｐｍＤ’整合进入脱色希瓦氏菌Ｓ１２，所述的融合基因ＳＰｒｔｐｍＤ’是在脱色希瓦氏菌Ｓ１２的ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ脱氢酶基因启动子序列之后连接三苯基甲烷染料脱色酶修饰基因ｔｐｍＤ’构成，所述的三苯基甲烷染料脱色酶修饰基因ｔｐｍＤ’，是在三苯基甲烷染料脱色酶基因ｔｐｍＤ的５’端起始密码子前加有ＳＤ序列，在３’端终止密码子之前加有能螯合双砷荧光染料的编码６个氨基酸的小标签。本发明专利技术用于环境修复和治理中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
及环境工程领域，具体涉及一种荧光示踪多功能脱色的脱色希 瓦氏工程菌及其构建方法。技术背景-染料和染料废水对环境的污染以及对人类的危害已广为世人所关注，己经成为全球性的 生态环境问题。控制和消除这一污染已引起各国学者的高度重视。实践证明，厌氧一好氧生 物强化处理体系是最经济有效的技术。生物强化技术的实现途径有①投加有效降解的微生 物；②优化现有处理系统的营养供给；③投加基因工程菌。目前，印染废水处理生物强化最为普遍的方式为直接投加经过筛选、驯化后对目标污染 物具有降解能力的微生物。这种方式整体水平上效率低、脱色率不高、脱色范围单一、处理 时间长。偶氮、蒽醌和三苯基甲烷类染料是目前应用最为广泛的三大类染料。脱色希瓦氏菌 ^co/oraom》S12是本专利技术人的研究团队分离的、已在实验室水平和工程实践中 证明的可有效进行生物强化的优秀高效菌株，该菌株对目前应用广泛的偶氮和蒽醌两大类染料的脱色能力较强，但对三苯基甲垸染料脱色能力较弱。嗜水气单胞菌^^0附0^/23^印/7/&subspDN322是本专利技术人的研究团队从印染废水处理厂的活性污泥中分离到的一株对结晶紫、 碱性品红、灿烂绿及孔雀绿等多种三苯基甲烷类染料具有高效脱色能力的嗜水气单胞菌。从 该菌中分离到一种新的三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD，三苯基甲垸类染料脱色酶TpmD蛋 白分子量为58.8kDa，等电点为5.6。酶蛋白是由两个相同分子量的亚基组成的二聚体，每个 亚基的分子量为29.4kDa。该酶能够催化结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀石绿等多种三苯 基甲烷类染料脱色降解，对底物具有结构专一性，能够高效脱色降解三苯基甲烷染料的菌株， 但由于这类菌对鱼类、蛙类具有潜在的致病性，从而限制了该菌株在环境生物修复中的应用。 因此构建能够应用于实现生物强化的具有脱色范围广、脱色效率高、遗传稳定性好的新的基 因工程菌显得非常必要。由于目前生物强化用基因工程菌(geneticallyengineeredmicroorgantsms， GEMS)在各种处 理系统中的存活情况和时空数量变化的监控和追踪仍然是目前的技术难点，因此赋予遗传稳 定性好、降解效率高、降解范围广的基因工程菌可示踪性对于生物强化技术进一步发展具有 重要意义。
技术实现思路
-本专利技术的目的是在对脱色希瓦氏菌S12和嗜水气单胞菌DN322对不同染料的脱色特点研 究的基础上，通过基因工程技术，提供一种对偶氮、蒽醌和三苯基甲垸类染料三大类染料都 具有高效脱色能力，并且具有荧光示踪功能的基因工程菌及其构建方法。本专利技术通过下述方案予以实施的本专利技术所述的荧光示踪多功能脱色的脱色希瓦氏工程菌是将外源基因整合进入染色体中，所述的外源基因是融合基因5尸r^M7^T ，所述的融合基因57t^D^r是在脱色希瓦氏菌 S12的NAD(P)H脱氢酶基因启动子序列5Pr之后连接三苯基甲烷染料脱色酶修饰基因t/M /T 构成，所述的三苯基甲垸染料脱色酶修饰基因，是在三苯基甲烷染料脱色酶基因^历 的5'端起始密码子ATG前加有SD序列，在3'端终止密码子之前加有能螯合双砷荧光染料 的编码6个氨基酸(CCPGCC)的小标签，所述的序列如SEQ1所示，所述的NAD(P)H 脱氢酶基因启动子序列如SEQ2所示，所述的SD序列如SEQ7所示，所述的螯合双砷荧光染 料编码CCPGCC六个氨基酸的碱基序列如SEQ6所示，所述的工程菌能分泌能螯合双砷荧光 染料的三苯基甲垸染料脱色酶。所述的荧光示踪多功能脱色的脱色希瓦氏菌工程菌的构建方法，其步骤如下-a) /pw'序列的获取应用PCR技术，以嗜水气单胞菌DN322的DNA为模板，扩增 出三苯基甲烷染料脱色酶基因^m，在其5'端的起始密码子前加有SD序列，在其 在3'端终止密码子之前加螯合双砷荧光染料的编码CCPGCC六个氨基酸的碱基序 列，将此序列命名为/pwD'。b) 脱色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脱氢酶基因启动子SiV的获取以脱色希瓦氏菌S12 基因组DNA为模板PCR扩增NAD(P)H脱氢酶基因的启动子序列。c) 片段五E4的获取以脱色希瓦氏菌S12基因组DNA为模板，PCR扩增而得片段五E4。d) 片段五FS的获取以脱色希瓦氏菌S12基因组DNA为模板，PCR扩增而得片段5i^。e) 5TV伊wD'的构建利用TP-PCR技术，在伊w'序列5'端前加脱色希瓦氏菌S12的 NAD(P)H脱氢酶基因启动子S/V，从而构建成S/V伊w'。f) 五E4S户n^wD'的构建利用TP-PCR技术，在S尸W/mD'的5'端前加片段而构建 成。g) EFAS7V^7wZ)'fF5的构建，利用TP-PCR技术，在￡化5TV伊wD'的3'端加片段￡F5。h) 将构建好的￡E4SPn^m￡ 电击转化到脱色希瓦氏菌S12中。i) 利用同源重组使￡E4SiV^w￡>'￡i^整合到脱色希瓦氏菌S12基因组染色体。j)通过PCR验证，脱色能力测定，荧光筛选，获得脱色希瓦氏菌S12基因工程菌。所述的片段EFA是脱色希瓦氏菌S12 —不编码蛋白的基因间区上半部分，其序列如SEQ3 所示，所述的片段是脱色希瓦氏菌S12 —不编码蛋白的基因间区下半部分，其序列如 SEQ4。所述的PCR验证筛选是通过以荧光示踪多功能脱色的脱色希瓦氏菌S12工程菌的基因组 DNA为模板PCR扩增五E4Si^/7wD'五F5 , SiW; mZ)'， ^附'片段测定分析的，选取能同时 扩增出^T^S7^; wZ)'五F5 , S7V(pwZ)', /pm'片段的菌株为目的菌株。所述的脱色能力筛选是通过将脱色希瓦氏菌S12基因工程菌对偶氮、蒽醌和三苯基甲烷 类染料进行脱色能力测定，选取对偶氮、蒽醌和三苯基甲烷类染料具有高效脱色作用的为目 的菌株。所述的荧光筛选是通过显微镜对脱色希瓦氏菌S12基因工程菌进行分析的，选取具有四 半胱氨酸一双砷荧光标记的菌株为目的菌株。用于本专利技术的嗜水气单胞菌DN322和脱色希瓦氏菌S12，其中嗜水气单胞菌DN322己 经在文献中公开记载(参考文献细菌脱色酶7>mD对三苯基甲垸类染料脱色的酶学特性 研究，任随周，郭俊，王亚丽，岑英华，孙国萍微生物学报，第46巻第3期，第385 389页，2006年4月；细菌脱色酶的酶学特性研究，任随周，郭俊，王亚丽，岑英 华，孙国萍微生物学报，第46巻第5期，第823 826页，2006年10月)，其中脱色希瓦 氏菌S12也在文献中公开记载(参考文献脱色希瓦氏菌(幼ewae〃a ^co/oraom》S12的 脱色特性，许玫英，钟小艳，曹渭，郭俊，岑英华，孙国萍；微生物学通报，第32巻第1 期，第5-9页，2005年)上述两微生物本申请人持有，并且保证可以在本专利技术申请日起20 年内向公众提供。本专利技术构建的荧光示踪多功能脱色的脱色希瓦氏菌S12工程菌通过实验证明，该细菌具 有脱色范围广，对偶氮、蒽醌和三苯基甲垸三大类染料都具有脱色作用，并且具有脱色效率 高，其对上述三种染料脱色能力与嗜水气单胞菌DN322对三苯基甲烷染料和脱色希瓦氏菌 S12对偶氮和蒽醌类染料的的脱色能力相当，遗传稳定性好等优点。由于选择的是S12染色 体上一段没有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光示踪多功能脱色的脱色希瓦氏工程菌，其特征在于所述的工程菌是将外源基因整合进入染色体中，所述的外源基因是融合基因ＳＰｒｔｐｍＤ’，所述的融合基因ＳＰｒｔｐｍＤ’是在脱色希瓦氏菌Ｓ１２的ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ脱氢酶基因启动子序列ＳＰｒ之后连接三苯基甲烷染料脱色酶修饰基因ｔｐｍＤ’构成，所述的三苯基甲烷染料脱色酶修饰基因ｔｐｍＤ’，是在三苯基甲烷染料脱色酶基因ｔｐｍＤ的５’端起始密码子ＡＴＧ前加有ＳＤ序列，在３’端终止密码子之前加有能螯合双砷荧光染料的编码６个氨基酸（ＣＣＰＧＣＣ）的小标签，所述的ｔｐｍＤ序列如ＳＥＱ１所示，所述的ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ脱氢酶基因启动子序列如ＳＥＱ２所示，所述的ＳＤ序列如ＳＥＱ７所示，所述的螯合双砷荧光染料编码ＣＣＰＧＣＣ六个氨基酸的碱基序列如ＳＥＱ６所示，所述的工程菌能分泌能螯合双砷荧光染料的三苯基甲烷染料脱色酶。

【技术特征摘要】
1. 一种荧光示踪多功能脱色的脱色希瓦氏工程菌，其特征在于所述的工程菌是将外源基因整合进入染色体中，所述的外源基因是融合基因SPrtpmD’，所述的融合基因SPrtpmD’是在脱色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脱氢酶基因启动子序列SPr之后连接三苯基甲烷染料脱色酶修饰基因tpmD’构成，所述的三苯基甲烷染料脱色酶修饰基因tpmD’，是在三苯基甲烷染料脱色酶基因tpmD的5’端起始密码子ATG前加有SD序列，在3’端终止密码子之前加有能螯合双砷荧光染料的编码6个氨基酸(CCPGCC)的小标签，所述的tpmD序列如SEQ1所示，所述的NAD(P)H脱氢酶基因启动子序列如SEQ2所示，所述的SD序列如SEQ7所示，所述的螯合双砷荧光染料编码CCPGCC六个氨基酸的碱基序列如SEQ6所示，所述的工程菌能分泌能螯合双砷荧光染料的三苯基甲烷染料脱色酶。2. 如权利要求l所述的脱色希瓦氏工程菌的构建方法，其特征在于包括下列步骤a) ^wZ)'序列的获取应用PCR技术，以嗜水气单胞菌DN322的DNA为模板，扩增出 三苯基甲垸染料脱色酶基因^附Z)，在其5'端的起始密码子前加有SD序列，在其在3' 端终止密码子之前加螯合双砷荧光染料的编码CCPGCC六个氨基酸的碱基序列，将 此序列命名为^w/)';b) 脱色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脱氢酶基因启动子SiV的获取以脱色希瓦氏菌S12 基因组DNA为模板PCR扩增NAD(P)H脱氢酶基因的启动子序列；c) 片段五E4的获取以脱色希瓦氏菌S12基因组DNA为模板，PCR扩增而得片段5E4， 该片段的序列如SEQ3所示；d) 片段的...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙国萍，卫晋波，任随周，许玫英，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]