【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学和基因工程，具体涉及一种表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母及其构建方法和应用。
技术介绍
1、β-葡萄糖苷酶是一种外切型糖苷水解酶，可以水解结合于非还原性末端的β-d-葡萄糖苷键，释放出葡萄糖体和相应的配基。目前，已经报道了许多β-葡萄糖苷酶用于催化普通人参皂苷合成稀有人参皂苷compound k的研究，但是存在酶的活性及稳定性差，酶回收困难等问题。
2、为了克服这些问题，本专利技术提出了利用酿酒酵母表面展示β-葡萄糖苷酶的方案。表面展示技术是一种将外源蛋白定位到宿主细胞表面的技术，它集成了表达、纯化、固定于一体的特点，省去分泌蛋白提取纯化和固定化的繁琐工艺流程，并且回收方便，可多次重复使用，因此广泛应用于生物技术和生物工程领域，包括疫苗开发、蛋白质工程、生物催化以及生物燃料生产等。因此，构建β-葡萄糖苷酶的表面展示菌株作为全细胞催化剂用于催化合成稀有人参皂苷compound k具有很大的实际意义。
3、然而，传统的酵母表面展示系统在某些应用中存在着一定的局限性，例如细胞表面的蛋白负载能力有限，这可能会限制外源蛋白的展示效率。此外，外源蛋白的表达效率也常常受到挑战。因此如何提高酿酒酵母表面展示β-葡萄糖苷酶的展示量和展示效率仍是一个急需解决的问题，也为稀有人参皂苷compound k的生产提供了新思路。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母及其构建方法
2、为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母，其特征在于，所述重组酿酒酵母菌株中引入了来源于硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)的β-葡萄糖苷酶bgly基因；所述重组酿酒酵母为saccharomyces by4741 ased1/bgly-sed1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no：31680，保藏日期为2024年8月19日。
3、上述的一种表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母，其特征在于，将所述β-葡萄糖苷酶bgly基因与锚定蛋白序列进行融合，再与启动子、信号肽和终止子表达盒融合，导入经过修饰的酿酒酵母宿主中进行表面展示表达，获得表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株。
4、上述的一种表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶bgly基因的核苷酸序列是按照酿酒酵母密码子偏好性进行优化，核苷酸序列如seq idno:1所示，氨基酸序列如seq id no:2所示。
5、上述的一种表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母，其特征在于，所述锚定蛋白的基因为来源于酿酒酵母by4741的截短的sed1，核苷酸序列如seq id no:3所示，连接在bgly基因的c端；氨基酸序列如seq id no:4所示。
6、上述的一种表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母，其特征在于，所述表达盒中表达β-葡萄糖苷酶bgly的信号肽为来源于酿酒酵母by4741的sed1基因的信号肽sed1sp，核苷酸序列如seq id no:5所示；所述表达盒中表达β-葡萄糖苷酶bgly的启动子为来源于酿酒酵母by4741的sed1基因的启动子sed1p，核苷酸序列如seq id no:6所示；所述表达盒的终止子为来源于酿酒酵母by4741的cyc1基因终止子tcyc1，核苷酸序列如seq id no:7所示。
7、上述的一种表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母，其特征在于，所述修饰的酿酒酵母宿主为敲除了sed1基因的酿酒酵母细胞by4741。
8、进一步地，本专利技术还提供了一种上述的重组酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
9、步骤一、以酿酒酵母by4741全基因组为模板，分别pcr扩增获得sed1基因的启动子、信号肽、终止子、sed1锚定蛋白和tcyc1基因终止子的基因片段，与β-葡萄糖苷酶bgly基因和ura3基因序列，通过重叠延伸pcr获得融合片段sed1p-sed1sp-bgly-sed1-tcyc1-ura3；
10、步骤二、以酿酒酵母by4741全基因组为模板，扩增rdna位点上下游同源臂，添加在融合片段的两端，合成融合片段rdnaup-sed1p-sed1sp-bgly-sed1-tcyc1-ura3-rdnadown；
11、步骤三、敲除酿酒酵母by4741的sed1基因，获得宿主细胞by4741δsed1感受态细胞；
12、步骤四、将步骤二中的融合片段以同源重组方式整合至步骤三的by4741δsed1感受态细胞中，均匀涂布在不含尿嘧啶的培养基中，筛选出重组酿酒酵母菌株。
13、更进一步地，本专利技术还提供了上述重组酿酒酵母在催化合成稀有人参皂苷compound k中的应用。
14、上述的应用，其特征在于，将所述重组酿酒酵母菌株进行发酵培养，离心收集菌体，然后以普通人参皂苷rb1为底物进行催化反应，得到稀有人参皂苷compound k。
15、上述的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：
16、步骤一、将所述重组酿酒酵母的种子液接种到sc-ura液体培养基中，于30℃，220rpm振荡培养24h；
17、步骤二、以初始od600＝0.1转接至ypd液体培养基，30℃，220rpm摇瓶培养72h，发酵结束后，离心收集菌体；
18、步骤三、以普通人参皂苷rb1为底物，用步骤二所得菌体进行催化反应，得到稀有人参皂苷compound k。
19、本专利技术与现有技术相比具有以下优点：
20、1.本专利技术利用表面展示技术将β-半乳糖苷酶展示在酿酒酵母细胞表面，通过优化表达盒元件以及宿主细胞，得到一株表面展示β-半乳糖苷酶bgly的重组酿酒酵母菌株by4741δsed1/blgy-sed1，最高水解酶活为50.36u/ml。
21、2.本专利技术的表面展示β-糖苷酶的重组酿酒酵母菌株可以催化合成稀有人参皂苷compound k，转化效率可达89.72％以上，重复利用10次的转化率仍可达50％。
22、3.本专利技术的重组酿酒酵母菌株可实现β-葡萄糖苷酶的高效固定与重复使用，同时也为酶催化法制备稀有人参皂苷compound k提供了新型全细胞催化剂，具有良好的工业化应用前景。
23、下面结合附图和实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。
24、说明书附图
25、图1为融合片段示意图。
26、图2为敲除表达盒片段sed1up-kanmx-sed1down示意图。
27、图本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母，其特征在于，所述重组酿酒酵母菌株中引入了来源于硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的β-葡萄糖苷酶BGLY基因；所述重组酿酒酵母为Saccharomyces BY4741ASED1/BGLY-SED1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：31680，保藏日期为2024年8月19日。
2.根据权利要求1所述的一种表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母，其特征在于，将所述β-葡萄糖苷酶BGLY基因与锚定蛋白序列进行融合，再与启动子、信号肽和终止子表达盒融合，导入经过修饰的酿酒酵母宿主中进行表面展示表达，获得表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株。
3.根据权利要求1所述的一种表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶BGLY基因的核苷酸序列是按照酿酒酵母密码子偏好性进行优化，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求2所述的一种表面展示β-葡萄糖苷酶的重
5.根据权利要求2所述的一种表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母，其特征在于，所述表达盒中表达β-葡萄糖苷酶BGLY的信号肽为来源于酿酒酵母BY4741的SED1基因的信号肽SED1SP，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述表达盒中表达β-葡萄糖苷酶BGLY的启动子为来源于酿酒酵母BY4741的SED1基因的启动子SED1P，核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述表达盒的终止子为来源于酿酒酵母BY4741的CYC1基因终止子tCYC1，核苷酸序列如SEQID NO:7所示。
6.根据权利要求2所述的一种表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母，其特征在于，所述修饰的酿酒酵母宿主为敲除了SED1基因的酿酒酵母细胞BY4741。
7.如权利要求1～6中任一权利要求所述的重组酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.如权利要求1～6中任一权利要求所述重组酿酒酵母在催化合成稀有人参皂苷Compound K中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述重组酿酒酵母菌株进行发酵培养，离心收集菌体，然后以普通人参皂苷Rb1为底物进行催化反应，得到稀有人参皂苷CompoundK。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母，其特征在于，所述重组酿酒酵母菌株中引入了来源于硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)的β-葡萄糖苷酶bgly基因；所述重组酿酒酵母为saccharomyces by4741ased1/bgly-sed1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no：31680，保藏日期为2024年8月19日。
2.根据权利要求1所述的一种表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母，其特征在于，将所述β-葡萄糖苷酶bgly基因与锚定蛋白序列进行融合，再与启动子、信号肽和终止子表达盒融合，导入经过修饰的酿酒酵母宿主中进行表面展示表达，获得表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株。
3.根据权利要求1所述的一种表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶bgly基因的核苷酸序列是按照酿酒酵母密码子偏好性进行优化，核苷酸序列如seq id no:1所示，氨基酸序列如seq id no:2所示。
4.根据权利要求2所述的一种表面展示β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母，其特征在于，所述锚定蛋白的基因为来源于酿酒酵母by4741的截短的sed1，核苷酸序列如seq id no:3所示，连接在bgly基因的c端；氨基酸序列如seq id...
【专利技术属性】
技术研发人员：王盼，侯晓雨，范代娣，罗怡姿，惠俊峰，李伟娜，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：
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