【技术实现步骤摘要】
【】本专利技术属于生物功能纳米材料领域，具体涉及一种用于h2o2无酶检测和肿瘤细胞筛分的荧光金纳米簇，其结构包含超小尺寸金核以及具有多巴基团的配体，能够催化h2o2分解产生·oh，同时表面配体被氧化生成醌类化合物并引起金纳米簇荧光淬灭，利用其荧光发射强度的变化能够直接检测溶液中h2o2的含量，还可以检测细胞裂解液以及活细胞内部h2o2的含量用于肿瘤细胞的筛分。
技术介绍
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技术介绍
1、过氧化氢(h2o2)通常与超氧阴离子(o2-)、羟基自由基(·oh)等并称为活性氧，在生物体内的细胞信号传导和体内平衡有着重要作用。h2o2作为信号分子，参与细胞增殖、代谢等许多生理过程，当细胞内h2o2过量时会造成氧化应激，对核酸产生损害并且容易导致某些疾病的发生，例如阿尔兹海默症、细胞癌变等(acs omega,2019,4(14):16242-16246.)。相较于正常细胞，肿瘤细胞中h2o2含量往往会更高。利用对细胞内h2o2水平的评估，进而可实现对肿瘤细胞的筛分。因此，定量检测h2o2有助于监测身体状态，实现疾病的早期诊断，在生物医学领域具有重要意义。
2、目前常见的h2o2检测方法需要生物酶的参与，例如，很多电化学检测法需要将辣根过氧化物酶(hrp)固定在电化学传感器上以实现对h2o2的检测(cn102175731b，2013.11.13)。但有机生物酶的实验条件较为苛刻，具有成本高、不稳定、易失活等局限性。针对这些挑战，科研人员引入了具有酶催化活性的纳米材料来替代生物酶，实现对h2o2的比色检测分析(c
3、基于以上事实，我们制备了一种具有催化和检测双功能的无酶荧光金纳米簇dpauncs，凭借超小尺寸可跨膜进入细胞，检测细胞内h2o2并通过全细胞荧光成像筛分肿瘤细胞，其具有水溶性好、选择性强、生物相容性良好等优点。
技术实现思路
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技术实现思路
1、本专利技术的主要目的是提供一种具有催化以及指示双重功能的荧光金纳米簇，不需要外加生物酶，以简单的单组分体系实现h2o2的检测和肿瘤细胞的成像筛分。
2、为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：
3、本专利技术提供的无酶的单组分荧光金纳米簇的制备方法，包括如下步骤：
4、(1)将氯金酸溶液和谷胱甘肽(glutathione)溶液混合均匀，室温下静置一段时间。之后加入含有多巴和巯基基团的配体溶液，在高温水浴环境下反应合适的时间，反应完毕后超滤纯化得到即可得到金纳米簇dpauncs。
5、(2)其中，所述步骤(1)中三种原料比例为氯金酸、谷胱甘肽、含有多巴和巯基基团的配体＝2:2.4-2.8:1.0-1.4，优选地，选择比例为2:2.6:1.2。
6、其中，所述含有多巴和巯基基团的配体，是将多巴作为类氨基酸单体，利用肽键将多巴与天然氨基酸以一定序列连接的类三肽化合物，其序列可以是dpce(多巴-半胱氨酸-谷氨酸)、dpcr(多巴-半胱氨酸-精氨酸)和dpcdp(多巴-半胱氨酸-多巴)，优选地，为dpce。
7、其中，所述步骤(1)中静置时间为5-15min，优选地，为10min。
8、其中，所述步骤(1)中反应温度为65-80℃，优选地，为70℃。
9、其中，所述步骤(1)中反应时间为26-32h，优选地，为30h。
10、本专利技术还提供了一种dpauncs对h2o2浓度的体外检测和用于细胞内检测的方法，该方法步骤如下：
11、(1)利用荧光光谱仪测量dpauncs在404nm激发下荧光发射光谱。
12、(2)用缓冲溶液配制不同浓度的h2o2溶液，分别与dpauncs混合孵育。
13、(3)将所述步骤(2)中得到的溶液使用荧光光谱仪在404nm激发下测量荧光发射光谱。
14、(4)取所述步骤(3)得到的一系列荧光发射光谱在600nm处的荧光强度与空白的荧光强度做比值(f/f0)作图，得到dpauncs荧光强度和h2o2浓度的线性关系。
15、(5)选取h2o2含量低的小鼠成纤维细胞(nih3t3)和中国仓鼠卵巢细胞(cho)作为阴性组，选取h2o2含量升高的人肺癌细胞(a549)和人肝癌细胞(hepg2)作为阳性组，将dpauncs溶液与上述四种细胞的细胞裂解液混合孵育。
16、(6)将所述步骤(5)中得到的溶液使用荧光光谱仪在404nm激发下测量荧光发射光谱。
17、(7)将nih3t3、cho、a549、hepg2四种细胞与dpauncs共孵育一段时间后制作细胞爬片，拍摄共聚焦荧光照片。
18、其中，所述步骤(7)中dpauncs浓度为0.05-0.25mg/ml，优选地，为0.15mg/ml。
19、其中，所述步骤(7)中共孵育时间为2-6h，优选地，为4h。
20、与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
21、(1)dpauncs不含生物酶且为单组分体系，具有催化和指示双重功能，能够催化h2o2分解为具有强氧化性的·oh，随即氧化表面含多巴和巯基基团的配体产生醌类化合物，淬灭金纳米簇的荧光。以单组分和超小尺寸优势可跨膜进入细胞并检测细胞中的h2o2，通过检测细胞裂解液以及活细胞内部h2o2含量来实现肿瘤细胞的筛分。因其单组分特性而不会受到细胞对不同物质内化效率差异的影响。可实现以无需外加生物酶的单组分体系对h2o2定量检测和肿瘤细胞筛分。
22、(2)dpauncs制备方法简单、水相分散性好、荧光性质稳定，在实际应用中有广泛的应用前景。
23、(3)dpauncs对h2o2的选择性好、生物相容性优良、灵敏度高，其荧光强度与h2o2的浓度存在线性关系，具有较低的检测限，能够实现对h2o2含量的定量测定。
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1.一种用于H2O2无酶检测和肿瘤细胞筛分的金纳米簇，其特征在于，以氯金酸、谷胱甘肽、含有多巴和巯基基团的配体为原料通过一步水热法制备得到，命名为DpAuNCs。
2.权利要求1所述的含有多巴和巯基基团的配体，其特征在于，是以多巴作为类氨基酸单体，利用肽键将多巴与天然氨基酸以一定序列连接的类三肽化合物。
3.权利要求1所述的金纳米簇DpAuNCs的制备方法，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的金纳米簇的制备方法，其特征在于，步骤(1)中各组分加入的浓度比例为氯金酸:谷胱甘肽:含有多巴和巯基基团的配体＝2:2.4-2.8:1.0-1.4，静置时间为5-15min。
5.根据权利要求3所述的金纳米簇的制备方法，其特征在于，步骤(2)中水浴加热时间为26-32h，反应温度为65-80℃。
6.根据权利要求3所述的DpAuNCs，其特征在于，激发波长为380-420nm，受到激发后产生以600nm为中心的的荧光发射。
7.根据权利要求3所述的DpAuNCs，其特征在于，金纳米簇的荧光变化值(F/F0)随H2O2浓
8.根据权利要求3所述的DpAuNCs，其特征在于，凭借单组分和超小尺寸特性，可跨细胞膜进入细胞内部，检测细胞内的H2O2。
...【技术特征摘要】
1.一种用于h2o2无酶检测和肿瘤细胞筛分的金纳米簇，其特征在于，以氯金酸、谷胱甘肽、含有多巴和巯基基团的配体为原料通过一步水热法制备得到，命名为dpauncs。
2.权利要求1所述的含有多巴和巯基基团的配体，其特征在于，是以多巴作为类氨基酸单体，利用肽键将多巴与天然氨基酸以一定序列连接的类三肽化合物。
3.权利要求1所述的金纳米簇dpauncs的制备方法，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的金纳米簇的制备方法，其特征在于，步骤(1)中各组分加入的浓度比例为氯金酸:谷胱甘肽:含有多巴和巯基基团的配体＝2:2.4-2.8:1.0-1.4，静置时间为5-15m...
【专利技术属性】
技术研发人员：王晓娟，李金奥，齐子纯，魏一凡，陈炜龙，何佳华，黄方，
申请(专利权)人：中国石油大学华东，
类型：发明
国别省市：
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