一种竞争性介导等温扩增联用Cas14a酶检测酿脓链球菌的方法技术

本发明专利技术涉及建立一种病原菌检测的方法，将竞争性介导等温扩增技术(competitive annealing mediated isothermal amplification，CAMP)与Cas14a检测系统结合，实现病原菌目的基因片段的等温快速扩增，然后利用Cas14a酶的特异性靶向激活机制获得信号放大，最后通过酶标仪或可视化观察读取检测结果。本发明专利技术的意义在于利用竞争性介导等温扩增技术的高灵敏性与操作便捷快速，Cas14a酶识别单链核酸无PAM位点限制特点以及高特异性，提高了本方法的广适性、特异性、灵敏性，而且荧光信号的快速、直观读取使其可用于现场检测，满足及时快速的诊断需求，在核酸诊断领域具有重要的应用潜力与经济价值。

【技术实现步骤摘要】

技术介绍

1、现如今，由病原微生物引起的传染性疾病正在严重威胁着全世界人类的生命健康，亟需开发新型的快速、灵敏、特异性的核酸诊断工具以控制传染病的传播。

2、病原微生物核酸诊断技术有很广泛的应用领域，例如poct、食品安全、环境检测等领域。食源性疾病是食品安全的头号问题，主要是由致病性微生物引起的，而且传染性很强，如酿脓链球菌、沙门氏菌、李斯特菌等。酿脓链球菌（又称a组链球菌）每年在世界范围内会感染1810万人，导致50万人的死亡。因此，有必要建立有效的检测技术及时阻断病原菌的传播。

3、目前对病原菌的诊断技术主要有传统的培养分离法、免疫检测技术以及核酸检测技术。但是培养分离法与免疫检测技术存在一些不足之处，如操作复杂，费时且昂贵，而且特异性与灵敏度性能不足。当前，基于pcr的核酸诊断技术是病原微生物的鉴定金标准，但一般依赖于昂贵的设备、专业人员，同时还需要较长的反应时间（~2h）。

4、近几十年来，等温扩增技术凭借其简易、快速、低成本的优点，成为常规的pcr技术的替代方法一直以来都备受瞩目。目前，一些等温扩增技术已有本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种竞争性介导等温扩增联用Cas14a酶检测酿脓链球菌的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

2.根据竞争性介导等温扩增联用Cas14a酶检测技术，其特征在于：所述步骤一具体如下：筛选目标微生物的特异性基因，确定高特异性的保守序列区域，设计对应的引物组，利用提取的微生物基因组，在恒温条件下完成目的片段的扩增。

3.根据竞争性介导等温扩增联用Cas14a酶检测技术，其特征在于：所述步骤二具体如下：特异性sgRNA设计靶向竞争性介导扩增产物的单链茎环区域，可避免Cas14a酶识别所需的PAM位点限制。待步骤一结束后，直接将扩增产物与Cas14a检测体系进行孵育...

【技术特征摘要】

1.一种竞争性介导等温扩增联用cas14a酶检测酿脓链球菌的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

2.根据竞争性介导等温扩增联用cas14a酶检测技术，其特征在于：所述步骤一具体如下：筛选目标微生物的特异性基因，确定高特异性的保守序列区域，设计对应的引物组，利用提取的微生物基因组，在恒温条件下完成目的片段的扩增。

3.根据竞争性介导等温扩增联用cas14a酶检测技术，其特征在于：所述步骤二具体如下：特异性sgrna设计靶向竞争性介导扩增产物的单链茎环区域，可避免cas14a酶识别所需的pam位点限制。待步骤一结束后，直接将扩增产物与cas14a检测体系进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋凤阁，孟天，任义华，鲁琳，骆彦驰，黄娇媚，万逸，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：