一种分泌表达人Ｋａｌｌｉｓｔａｔｉｎ的重组酵母菌株及生产工艺制造技术

本发明专利技术涉及抗肿瘤药物人Ｋａｌｌｉｓｔａｔｉｎ的生产方法和工艺。本发明专利技术涉及分泌表达人Ｋａｌｌｉｓｔａｔｉｎ的酵母工程菌株构建的关键技术、构建结果及利用它来生产人Ｋａｌｌｉｓｔａｔｉｎ的最佳发酵条件和纯化方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子药物学，生物技术和疾病防治，具体地说是采用酵母菌株生产人 Kallistatin(Kal)的生产工艺，分泌表达载体的构建，发酵条件和纯化方法。
技术介绍
目前恶性肿瘤已经成为发达国家和地区居于前列的致死性疾病。虽然外科手术， 放疗和化疗作为的常规治疗手段仍在不断发展，但由于其固有的局限，其疗效已基本达到 极限，因而迫切需要开发新的治疗手段。 自从Folkman于1971年首次阐述肿瘤与新生血管依赖关系，并提出有关分子机制 假说以来，以肿瘤新生血管为靶点的抗血管生成治疗成为抗肿瘤研究的热点。 Kal是一新型的具有抗血管生成作用的内源性蛋白(Miao RQ， et al. Blood2002 ; 100 :3245-52)，其抗血管生成作用与内皮抑素(endostatin)类似。内皮抑素通过其肝素结 合活性介导其对血管生成的抑制作用。各种生长因子必须结合细胞表面两种不同的受体， 才能引发一个信号。硫酸肝素糖蛋白(HSPGs)是最普通的低吸附受体，在调节多种生长因 子的作用时，发挥关键作用。许多生长因子，如VEGF和bFGF是肝素结合生长因子，VEGF和 bFGF与内皮细胞表面的HSPGs结合，可以调节它们与专属受体的结合。Kal是肝素结合蛋 白，可以与VEGF和bFGF，以及其它含有肝素结合区的生长因子竞争结合HSPGs，因此阻断了 这些生长因子与HSPGs的结合，阻断了这些生长因子引发的血管生成事件。另外，Kal还是 丝氨酸蛋白酶抑制剂的一员，最初被认为是组织胰激肽原酶结合蛋白。越来越多的证据显 示，组织胰激肽原酶在肿瘤相关事件中非常重要，其中包括肿瘤生长调节，血管生成，侵入 和转移等。我们的研究发现，在Kal的作用下，HCC中作为细胞增殖的标志Ki-67染色降低， 显示Kal与组织胰激肽原酶的结合可能与HCC细胞增殖抑制有关。Kal可以从不同途径抑 制血管生成，因此是抗肿瘤血管生成治疗的良好候选者。 已进行的Kal的抗肿瘤作用研究主要采用基因治疗手段，而基因治疗一般需要采 用病毒载体，其长期应用的风险是各国卫生部门重点关注的问题，目前尚不明朗，很难在短 期内实现上市并广泛应用于肿瘤病人。而多种重组蛋白药物已广泛地应用于临床，相关技 术比较成熟，是开发基因重组药物最常规的手段。所以本领域研究人员试图建立一种高效 生产Kal重组蛋白的方法，研究其蛋白形式对肿瘤的作用，为新型抗肿瘤药物的开发奠定 基础。Kal的发现者Chao等曾采用大肠杆菌表达Kal重组蛋白，但表达量很低。本课题组 也曾用大肠杆菌表达人Kal蛋白，表达水平也极低，且杂蛋白多难以纯化。毕赤酵母表达系 统是近年来建立起来的一种真核表达系统，已成功地表达了大量的重组蛋白，它既具有原 核表达系统繁殖快、操作简单的优点，同时又具有原核表达系统所没有的优势如能对表达 的目的蛋白进行正确加工、折叠及适度糖基化，分泌表达的杂蛋白少，易于分离纯化等，因 此越来越广泛地用于重组蛋白的表达。国内外文献尚未有利用毕赤酵母表达Kal蛋白的报 道。本专利技术人利用毕赤酵母表达人Kal蛋白，发现采用常规的技术方法得到的重组菌株表 达水平很低，难以大规模生产。纯化工艺也比较复杂。现有市售酵母分泌型表达载体所用的信号肽几乎全是a交配因子信号肽，重组蛋白的翻译后加工需要两种不同的酶参与，往 往产生加工不均匀和不正确的现象，得到的重组蛋白的N端序列出现偏差。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题和缺陷，本专利技术对市售的酵母分泌型表达载体pPIC9进 行改造，并从发酵工艺和纯化工艺等多个环节进行最佳条件的摸索和优化，得到了可以高 效表达人Kal的分泌型表达酵母菌株，并建立了可以用于工业化生产的发酵工艺和纯化工 艺。 信号肽序列是分泌型酵母表达载体非常重要的表达元件，对于不同的目标蛋白， a交配因子信号肽往往不能有效、正确的转位和加工，因而所得到的目标蛋白的N端序列 经常不是天然序列。本专利技术对多种信号肽序列进行了筛选，从表达水平高低和N端序列正 确与否等多个方面进行了研究，确定了本专利技术载体的关键元件构成。 本专利技术采用廉价的B匪Y培养基即可成功地高水平分泌表达Kal蛋白。由于分泌 的Kal蛋白成分水平高，下游纯化非常方便，经两步层析纯度即可达到98%以上，非常便于 工艺化生产。附图说明 图1发酵上清液的Western Blot分析。条带1为酵母菌株GS115/p PIC9的发酵 上清液，无Kal的阳性反应；带1为酵母菌株Ka102的发酵上清液，呈现Kal的阳性反应。 箭头所指为Kal蛋白。 图2发酵时间对重组Kal蛋白表达的影响。条带1为分子量标志；条带2为酵母 菌株Kal02的发酵上清液；条带3为酵母菌株Kal02的第1天发酵上清液；条带4为酵母菌 株Kal02的第2天发酵上清液；条带5为酵母菌株Kal02的第3天发酵上清液；条带6为酵 母菌株Kal02的第4天发酵上清液；条带7为酵母菌株Kal02的第5天发酵上清液；条带7 为酵母菌株Kal02的第6天发酵上清液。箭头所指为Kal蛋白。 图3各纯化步骤产物的SDS-PAGE图谱。条带1为分子量标志；条带2为酵母菌株 Kal02的发酵上清液；条带3为Phenyl Superose疏水层析产物；条带4为S印harose FF 亲和层析产物。具体实施例方式l含a交配因子信号肽工程菌株的构建 1. 1表达载体pPIC9-Ka101的构建 以含有Kal cDNA全长序列的pAAV-Kal为模板，选用上游引物5' -aacctcgagaaa agagatggtgagagttgcagtaacagct-3' 弓l入Xho 1酶切位点，下游弓l物5' ccagaattcctatgg tttcgtggggtcgacgacc-3'引入EcoR I酶切位点，用Pyrobest DNA聚合酶，经PCR得到人 Kal成熟蛋白对应的DNA序列。目的片段回收、酶切后插入至pPIC9载体的Xhol/EcoRI位 点之间。转化后经菌落PCR、酶切等方法筛选出符合要求的阳性克隆，委托大连宝生物公司 对pPIC9-Ka101进行测序。 1. 2工程菌株KalOl的构建与鉴定4 pPIC9-Kal01表达载体经StuI线性化，电转化毕赤酵母GS115 (his4)宿主菌，涂布 MD平板，菌落PCR鉴定。将阳性克隆接种于含有3mL B匪Y酵母培养液的试管中，培养24h， 用2X甲醇诱导48小时，ELISA法测定目的蛋白含量。发酵上清液经SDS-PAGE分离后电转 至硝酸纤维素膜上，用封闭液封闭2h，滴加一抗室温孵育2h，洗涤液洗3次，滴加二抗室温 孵育2h，洗涤液洗3次，最后使用BeyoECL荧光检测试剂检测目的蛋白，X胶片曝光后显影、 定影。 2含人白蛋白信号肽工程菌株的构建 2. 1表达载体pPIC9-Ka102的构建 依据NCBI中报道的编码白蛋白信号肽(NP_000468)序列以及编码人成熟Kal蛋白序列设计引物，上游引物1 :5' -CAGGATCCCAAACGATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGC-3'，上游引物2 :5' -CCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达人ｋａｌｌｉｓｔａｔｉｎ的分泌型表达载体，该载体含有一个重组基因表达框，其特征在于表达框中含有去除了原信号肽序列的人ｋａｌｌｉｓｔａｔｉｎ的ｃＤＮＡ序列，原信号肽序列被更换为人白蛋白信号肽序列，该表达框被插入至甲醇酵母分泌型表达载体ｐＰＩＣ９的ＢａｍＨ　Ⅰ和ＥｃｏＲ　Ⅰ位点，构建成人ｋａｌｌｉｓｔａｔｉｎ分泌型表达载体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄晓平，李招发，刁勇，许瑞安，
申请(专利权)人：刁勇，许瑞安，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]