【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种生物标记磁珠的加工方法及其检测偶联效率的方法。
技术介绍
1、磁珠是医学、分子生物学、免疫学等研究中的重要载体工具。例如，羧基磁珠具有超顺磁性、快速磁响应性、高羧基含量、单分散性和亚微米尺度粒径等特点，羧基磁珠表面生物分子的修饰是利用edc缩合的方法，生物活性分子(多肽、蛋白、寡聚核苷酸等)可与磁珠表面的官能基团结合，广泛应用于分离、检测和临床诊断等领域中，因为其简便的操作和稳定的结果，得到越来越广泛的应用。
2、当利用磁珠偶联蛋白时，蛋白偶联效率是一个重要的评价指标，偶联效率的高低直接影响到后续实验的准确性和可靠性，若磁珠的蛋白偶联效率过低，则需要对偶联反应的条件进行优化。在利用羧基磁珠进行核酸适配体筛选时，磁珠蛋白偶联量直接影响后续核酸适配体筛选的效果。因此，如何简单、快速地对磁珠表面蛋白偶联效率和偶联量进行相对准确的定量测定，具有十分重要的研究意义。
3、专利cn202110579153.6公开了一种磁珠蛋白偶联效率的检测方法，具体是：将活化后的磁珠与蛋白进行偶联反应，得到偶联蛋白的磁珠，然后对所述偶联蛋白的磁珠表面未反应的结合位点进行荧光标记，得到待测样品；对活化后的磁珠表面的全部结合位点进行荧光标记，得到阳性对照品；以磁珠、活化后的磁珠或者偶联蛋白的磁珠作为空白对照品；测定待测样品、阳性对照品、空白对照品的荧光值，计算磁珠的蛋白偶联效率。该专利检测方法存在以下缺点：
4、1.偶联的蛋白表面存在大量的氨基，所以氨基活性基团的荧光染料无法实现定向偶联磁珠表
5、2.利用蛋白上的his标签结合荧光染料时，每个蛋白his标签暴露的情况不同，会导致结果产生一定的误差；而且这种方法只能定性，不能进行定量。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术所述的至少一个缺陷，本专利技术的目的之一是提供一种生物标记磁珠的加工方法，其可解决现有技术中测试偶联蛋白的磁珠的偶联效率的检测结果不准确的问题；
2、本专利技术的目的之二是提供一种检测偶联效率的方法，其可解决利用蛋白上的his标签结合荧光染料时，每个蛋白his标签暴露的情况不同，会导致结果产生一定的误差，而且现有技术只能定性，不能进行定量的问题。
3、本专利技术为解决其问题所采用的技术方案是：
4、一种生物标记磁珠的加工方法，应用于偶联效率检测，包括如下步骤：
5、s1、取若干磁珠，并将磁珠活化；
6、s2、对活化后的磁珠与蛋白偶联，获得偶联蛋白的磁珠；
7、s3、对偶联蛋白的磁珠表面未结合的位点使用生物素标记的分子进行标记，获得生物素标记的偶联蛋白的磁珠。
8、通过采用上述方案，通过在s3步骤中对偶联蛋白磁珠表面未结合位点进行生物素标记，能够特异性地识别并标记剩余未偶联的位点，从而通过对比标记前后发光值的差异，精确计算偶联效率，提高了检测的敏感性和准确性。在后续的检测偶联效率实验中，结合发光检测技术，实现偶联效率的直接量化评估，而非仅仅定性观察，极大地提高了评估结果的精确性和客观性。
9、并且，通过在s3步骤中对偶联蛋白磁珠表面未结合位点进行生物素标记，还可以准确反映出偶联反应的饱和度，帮助科研人员快速识别最佳偶联条件，如蛋白浓度、偶联时间和温度，优化偶联工艺，提升实验成功率。
10、另外，通过整合生物素标记与发光检测技术，简化了传统的偶联效率检测流程，减少了一些繁琐的中间步骤，降低了实验成本，同时缩短了实验周期，提高了实验室的工作效率。
11、进一步地，所述磁珠的粒径为0.1-30μm。
12、通过采用上述方案，通过设定磁珠的粒径为0.1-30μm，此尺寸优化了磁珠的表面积与体积比，既能保证足够的生物分子偶联位点，又易于与目标分子有效接触，提高了偶联效率与反应速度，同时减少了因粒径过大可能导致的传质限制或过小引起的物理稳定性问题。并且特定粒径的磁珠在流动或固定化过程中能更有效地减少非特异性吸附，确保实验结果的准确性和重复性，这对于需要高度纯净度和特异性的生物分子分离、检测实验非常重要。另外0.1-30μm的磁珠粒径适合自动化处理设备，如流式细胞仪、自动化工作站等，便于进行高通量筛选和分析，提高了实验的效率和处理能力。
13、进一步地，所述磁珠为羧基磁珠、氨基磁珠、巯基磁珠、生物素磁珠、硅羟基磁珠和磁性多糖基磁珠中的一种。
14、通过采用上述方案，提供了多种选择，拓展了应用范围，满足不同分子偶联需求，提高了技术的灵活性。
15、进一步地，所述磁珠为羧基磁珠，所述羧基磁珠的活化的具体步骤如下：
16、a1、将羧基磁珠放入naoh清洗，并用ddh2o清洗两次后，磁分离去除上层液体；
17、a2、加入羧基活化剂，在室温环境下，让磁珠与羧基活化剂充分振荡混匀并接触20至30分钟，磁分离弃上清；
18、a3、用超纯水快速清洗，以去除多余的羧基活化剂，再进行磁分离去上清液。
19、通过采用上述方案，通过使用naoh清洗去除表面杂质，确保了活化过程的纯净起点，加入羧基活化剂在特定条件下充分作用，增强了磁珠表面的反应活性，确保了高效且稳定的偶联反应基础。
20、并且通过多次清洗流程，有效减少了非特异性结合的风险，使得后续的生物标记和检测步骤更为准确，提高了数据的信噪比，对复杂生物样本的分析尤为有利。
21、进一步地，所述羧基活化剂为n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)的混合溶液，所述羧基活化剂由浓度为0.1mo l/l的nhs和浓度为0.4mo l/l的edc溶液按体积比1：1混合而成，所述羧基磁珠质量与羧基活化剂体积之比为1μg：1μl。
22、通过采用上述方案，使用浓度为0.1mo l/l的nhs和0.4mo l/l的edc按1:1体积比混合的活化剂方案，既考虑了nhs作为活化剂的效率，也兼顾了edc作为交联剂的功能，为偶联反应提供了最佳的化学环境，促进稳定且高效的共价偶联。该比例和活化条件的设定，确保了磁珠表面的每个羧基都能尽可能多地与蛋白或其他生物分子的氨基形成共价键，减少了未偶联位点，提高了偶联产物的稳定性和整体偶联效率，为后续的生物标记和检测提供更可靠的基底。
23、本专利技术还提供一种检测偶联效率的方法，包括如下步骤：
24、b1、将若干磁珠活化，并将活化后的磁珠分为四等份，分别为待测样品组、阳性对照品组、待测样品空白对照组和阳性空白对照组；
25、b2、所述待测样品组将活化后的磁珠与蛋白偶联，得到偶联蛋白的磁珠，后对本步骤中的偶联蛋白的磁珠表面未结合的位点利用生物素标记的分子进行标记；
26、b3、所述阳性对照品组将活化后的磁珠表面的全部结合位点使用生物素标记的分子标记；
27、b4、所述待测样品空白对照组将活化后本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生物标记磁珠的加工方法，应用于偶联效率检测，其特征在于：包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种生物标记磁珠的加工方法，其特征在于：所述磁珠的粒径为0.1-30μm。
3.根据权利要求1所述的一种生物标记磁珠的加工方法，其特征在于：所述磁珠为羧基磁珠、氨基磁珠、巯基磁珠、生物素磁珠、硅羟基磁珠和磁性多糖基磁珠中的一种。
4.根据权利要求1或2所述的一种生物标记磁珠的加工方法，其特征在于：所述磁珠为羧基磁珠，所述羧基磁珠的活化的具体步骤如下：
5.根据权利要求4所述的一种生物标记磁珠的加工方法，其特征在于：所述羧基活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的混合溶液，所述羧基活化剂由浓度为0.1mol/L的NHS和浓度为0.4mol/L的EDC溶液按体积比1：1混合而成，所述羧基磁珠质量与羧基活化剂体积之比为1μg：1μL。
6.一种检测偶联效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的一种检测偶联效率的方法，其特征在于，所述B
8.根据权利要求6所述的一种检测偶联效率的方法，其特征在于，所述生物素标记的分子为BSA和BSA-Biotin的混合溶液。
9.根据权利要求6所述的一种检测偶联效率的方法，其特征在于，所述B1、B2和B3步骤中的磁珠为羧基磁珠，其标记方法为：将活化后的羧基磁珠或者偶联蛋白的羧基磁珠加入BSA和BSA-Biotin的混合溶液中，在室温下振荡孵育1-3h进行标记，然后磁分离弃上清，清洗，再磁分离弃上清。
10.根据权利要求6所述的一种检测偶联效率的方法，其特征在于，所述B2-B5步骤中的磁珠为羧基磁珠，用链霉亲和素和碱性磷酸酶的融合蛋白(SA-AP)识别磁珠上的Biotin，再通过检测AP催化发光底物反应的发光值，实现Biotin的定量。
...【技术特征摘要】
1.一种生物标记磁珠的加工方法，应用于偶联效率检测，其特征在于：包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种生物标记磁珠的加工方法，其特征在于：所述磁珠的粒径为0.1-30μm。
3.根据权利要求1所述的一种生物标记磁珠的加工方法，其特征在于：所述磁珠为羧基磁珠、氨基磁珠、巯基磁珠、生物素磁珠、硅羟基磁珠和磁性多糖基磁珠中的一种。
4.根据权利要求1或2所述的一种生物标记磁珠的加工方法，其特征在于：所述磁珠为羧基磁珠，所述羧基磁珠的活化的具体步骤如下：
5.根据权利要求4所述的一种生物标记磁珠的加工方法，其特征在于：所述羧基活化剂为n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)的混合溶液，所述羧基活化剂由浓度为0.1mol/l的nhs和浓度为0.4mol/l的edc溶液按体积比1：1混合而成，所述羧基磁珠质量与羧基活化剂体积之比为1μg：1μl。
6.一种检测偶联效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗昭锋，吴金梦，徐晶，汪铃泓，冯梦楚，郭晗，张峥，刁寒，吕少康，高毓婉，
申请(专利权)人：中国科学院杭州医学研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。