本发明专利技术涉及一种电化学生物传感器的制备方法，特别涉及一种固定化乙酰胆碱酯酶方法及电流型生物传感器的制备方法。即利用电沉积技术将带有负电荷的碳纳米管沉积到玻碳电极表面，随后在聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液和碳纳米管分散液中进行层层静电自组装过程，得到自组装效率高、修饰层稳定的修饰电极。然后，在聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液和胆碱酯酶的ＰＢＳ（磷酸盐缓冲液）溶液中再进行层层自组装，得到稳定性较高的固定化乙酰胆碱酯酶电流型生物传感器，可以在常温下，迅速而稳定地检测残留农药中的对硫磷浓度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种电化学生物传感器的制备方法，特别涉及一种固 定乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器的制备方法。
技术介绍
有机磷农药在世界农业生产中有着不可替代的作用。随着WTO 的加入，我国与其他国家农产品的贸易额逐年增加，进口国对农产品 的质量提出越来越高的要求。为了提高我国农产品的安全质量，增强 国际竞争力，我国政府对农药残留问题十分重视，大力发展农药的速 测技术，加强对农产品的实时监测。加强农产品中农药残留的检测与 控制已成当务之急。国际上农药残留分析常用的是色谱法、色谱-质谱联用法等，但 是由于仪器复杂、昂贵、操作繁琐，常需要液-液萃取或固-液萃取等 前期处理过程，难于快速使用。针对我国当前的国情需要开发在常温 下的速测技术，及时确保上市农作物的食用安全。八十年代，蔬菜农药快速检测技术在国外一些国家已经广泛使 用。近年来，我国一些省市的蔬菜批发市场、蔬菜生产基地等也开始 使用速测法检测，但其检测原理均采用光电比色法，这类仪器检测灵 敏度较低，有的农残检测达不到国际或国内最低检测限标准，不利于 进一步推广普及。4近年来，随着生命科学和环境科学等领域的迅速发展，以生物材 料为基础的各种生物传感器的开发应用越来越受到关注，乙酰胆碱酯 酶电化学生物传感器应用于有机磷农药的检测就是其中之一 。乙酰胆碱酯酶(acetylcholinestemse， AChE)是一种能够选择性催 化底物乙酰胆碱水解的酶，在动物体内普遍存在。有机磷农药是AChE 的抑制剂，能使体内AChE活性明显降低。利用有机磷农药对AChE 活性的抑制，可测定环境样品中有机磷农药的含量。测定AChE活性 的重要方法之一是AChE生物传感器法。其中安培型AChE生物传感 器的原理为AChE催化底物乙酰硫代胆碱(acetylthiocholine， ATCh) 水解，生成硫代胆碱和乙酸，其中，硫代胆碱具有电化学活性，能在 电极上产生氧化还原电流，在一定条件下该电流的大小可间接反映 AChE的活性。碳纳米管修饰电极具有很好的电化学稳定性、良好的导电性、大 比表面积以及优良的电催化性能，能促进电活性物质的电子传递等优 点。目前，碳纳米管被用来作为电活性材料和电活性材料的载体已广 泛应用于电化学和生物传感器中，但将先电沉积后再层层自组装来固 定化酶，特别是应用于固定化乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器对对硫 磷的检测研究目前还尚未见报道。
技术实现思路
为了解决有机磷农药残留在常温下，响应敏捷，稳定性好的的速 测技术，开发了一种固定化乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器。 本专利技术采用的技术方案本研究根据等电点的大小使酶带上电荷，然后与带相反电荷的碳 纳米管修饰层以静电吸附的形式相互作用进行固定，构建了基于多壁 碳纳米管和聚二烯丙基二甲基氯化铵层层自组装的乙酰胆碱酯酶传 感器，并将其应用于有机磷农药对硫磷的实际检测。首先是利用电沉积技术将带有负电荷的碳纳米管沉积到玻碳电 极表面，随后在聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液和碳纳米管分散液中进 行层层静电自组装过程，得到自组装效率高、修饰层稳定的修饰电极。然后，在聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液和胆碱酯酶的PBS (磷酸盐 缓冲液)溶液中再进行层层自组装，得到稳定性较高的固定化乙酰 胆碱酯酶电流型化学生物传感器。其具体的制备步骤如下(1) 玻碳电极经过抛光、在pH5.00 8.00的磷酸盐缓冲液中循环伏安 扫描10圈进行电化学活化预处理后，与铂电极组成两电极系统 电沉积2小时，形成亮黑色的带有大量负电荷的碳纳米管电沉积 层；(2) 将步骤(1)中经过电沉积后的玻碳电极浸入到离子强度为 0.8mol丄的l。/。的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中，进行聚二 烯丙基二甲基氯化铵的静电自组装，10 15min后取出用去离 子水仔细冲洗2min，再浸入到pH7.0 10.0的四硼酸钠溶液作为 分散剂的浓度为0.5 1.5g，mL碳纳米管的分散液中，进行碳纳 米管的静电自组装，15min后取出，用去离子水小心冲洗2min， 至此，碳纳米管修饰层为l层，反复操作，直到碳纳米管的修饰层层数为5，最后，将得到的最外层为多壁碳纳米管的电极在红 外灯下烘干；(3)将步骤(2)中的所得的红外灯下烘干后的电极浸入到离子强度 为0.8molO;1的1 %的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中，进行聚 二烯丙基二甲基氯化铵的静电自组装，15min后取出用去离子 水仔细冲洗2min，再浸入至UpH为5.00 8.00的胆碱酯酶的磷酸缓 冲溶液分散液中，进行碳纳米管的静电自组装，15min后取出， 用去离子水小心冲洗2min，至此，胆碱酯酶修饰层为l层，反复 操作，直到胆碱酯酶的修饰层层数为3，为了更好的将酶固定， 继续将电极浸入聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中5min，即得 固定化乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器。本专利技术的有益效果由于胆碱酯酶有效地固定在碳纳米管修饰电极表面，保持了高的酶活力。因此，本专利技术的固定化乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器可以在常温下，迅速而稳定地检测残留农药中的对硫磷浓度。附图说明图l酶活力与电流变化的关系曲线图2酶抑制率与对硫磷浓度负对数关系曲线图3酶抑制率与浓度在10-1()—10、L范围内的对硫磷浓度的负对数的线性关系 具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明，但不限制本专利技术。实施例下面结合附图对本专利技术具体说明。固定化乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器的制备步骤如下(1) 玻碳电极经过抛光、在pH7.40的磷酸盐缓冲液中循环伏安扫描 1 O圈进行电化学活化预处理后，与铂电极组成两电极系统电沉 积2小时，形成亮黑色的带有大量负电荷的碳纳米管电沉积层。(2) 将步骤(1)中经过电沉积后的玻碳电极浸入到离子强度为 0.8mol丄的P/。的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中，进行聚二 烯丙基二甲基氯化铵的静电自组装，15min后取出用去离子水 仔细冲洗2min，再浸入到pH9.18的四硼酸钠溶液作为分散剂的 浓度为lmg^L碳纳米管的分散液中，进行碳纳米管的静电自 组装，15min后取出，用去离子水小心冲洗2min，至此，碳纳米 管修饰层为l层，反复操作，直到碳纳米管的修饰层层数为5， 最后，将得到的最外层为多壁碳纳米管的电极在红外灯下烘干。(3) 将步骤(2)中的所得的红外灯下烘干后的电极浸入到离子强度 为0.8mol丄的1%的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中，进行 聚二烯丙基二甲基氯化铵的静电自组装，15min后取出用去离 子水仔细冲洗2min，再浸入到pH为7.40的胆碱酯酶的磷酸缓 冲溶液分散液中，进行碳纳米管的静电自组装，15min后取出， 用去离子水小心冲洗2min，至此，胆碱酯酶修饰层为l层，反 复操作，直到胆碱酯酶的修饰层层数为3，为了更好的将酶固 定，继续将电极浸入聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中5min，即得固定化乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器。 固定化乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器的应用将制得的酶电极用于有机磷农药对硫磷的检测以6mLpJ^7.40 的PBS缓冲液为电解质，在介于O. 1 2.0V之间的固定电压(vs.SCE)下 测定其对氯化乙酰硫代胆碱的电流响应，所有测试均在25 40。C之间 进行。当固定化乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器被农药浸泡过之本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种固定化乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器的制备方法，其特征在于包括下列步骤： （１）玻碳电极经过抛光、在ｐＨ５．００～８．００的磷酸盐缓冲液中循环伏安扫描１０圈进行电化学活化预处理后，与铂电极组成两电极系统电沉积２小时，形成亮黑色的带有 大量负电荷的碳纳米管电沉积层； （２）将步骤（１）中经过电沉积后的玻碳电极浸入到离子强度为０．８ｍｏｌ.Ｌ↑［－１］的１％的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中，进行聚二烯丙基二甲基氯化铵的静电自组装，１０～１５ｍｉｎ后取出用去离子水仔细冲洗 ２ｍｉｎ，再浸入到ｐＨ７．０～１０．０的四硼酸钠溶液作为分散剂的浓度为０．５～１．５ｇ.ｍＬ↑［－１］碳纳米管的分散液中，进行碳纳米管的静电自组装，１５ｍｉｎ后取出，用去离子水小心冲洗２ｍｉｎ，至此，碳纳米管修饰层为１层，反复操作，直到碳纳米管的修饰层层数为５，最后，将得到的最外层为多壁碳纳米管的电极在红外灯下烘干； （３）将步骤（２）中的所得的红外灯下烘干后的电极浸入到离子强度为０．８ｍｏｌ.Ｌ↑［－１］的１％的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中，进行聚二烯丙基二甲基氯化铵 的静电自组装，１５ｍｉｎ后取出用去离子水仔细冲洗２ｍｉｎ，再浸入到ｐＨ为５．００～８．００的胆碱酯酶的磷酸缓冲溶液分散液中，进行碳纳米管的静电自组装，１５ｍｉｎ后取出，用去离子水小心冲洗２ｍｉｎ，至此，胆碱酯酶修饰层为１层，反复操作，直到胆碱酯酶的修饰层层数为３，为了更好的将酶固定，继续将电极浸入聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中５ｍｉｎ，即得固定化乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器。...
【技术特征摘要】
1.一种固定化乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器的制备方法，其特征在于包括下列步骤(1)玻碳电极经过抛光、在pH5.00～8.00的磷酸盐缓冲液中循环伏安扫描10圈进行电化学活化预处理后，与铂电极组成两电极系统电沉积2小时，形成亮黑色的带有大量负电荷的碳纳米管电沉积层；(2)将步骤(1)中经过电沉积后的玻碳电极浸入到离子强度为0.8mol·L-1的1％的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中，进行聚二烯丙基二甲基氯化铵的静电自组装，10～15min后取出用去离子水仔细冲洗2min，再浸入到pH7.0～10.0的四硼酸钠溶液作为分散剂的浓度为0.5～1.5g·mL-1碳纳米管的分散液中，进行碳纳米管的静电自组装，15min后取出，用去离子水小心冲洗2min，至此，碳纳米管修饰层为1层，反复操作，直到...
【专利技术属性】
技术研发人员：张淑平，郑祎，于大望，丁亚平，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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