鱼用浸泡疫苗多组合佐剂及其应用和使用方法技术

本发明专利技术涉及一种鱼用浸泡疫苗多组合佐剂及其应用和使用方法，包括Ｎ－乙酰半胱氨酸、曲拉通Ｘ－１００、皂角苷和消旋山莨菪碱的组合，其中Ｎ－乙酰半胱氨酸、曲拉通Ｘ－１００、皂角苷和消旋山莨菪碱的使用浓度分别为０．１－１０ｍｇ／Ｌ、０．１－１０ｍｇ／Ｌ、０．１－５０ｍｇ／Ｌ和１－６０ｍｇ／Ｌ。应用于包括海水和淡水鱼类的浸泡疫苗中协同作用达到高效的免疫效果。使用方法首先选用待免疫鱼类，将待免疫的鱼移入Ｎ－乙酰半胱氨酸、曲拉通Ｘ－１００、混合养殖用水溶液中预浸泡１－２０ｍｉｎ，之后加入皂角苷及待用疫苗浸泡１－２０ｍｉｎ，再向疫苗浸泡液中加入消旋山莨菪碱待１－１０ｍｉｎ即完成免疫。本发明专利技术显著提高疫苗的免疫效果，方法简便安全，成本低，无需额外的设施与工序，且对鱼的存活率与生长速度没有影响，对环境及操作员同样无害。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及海洋生物疾病免疫防治技术，具体是鱼用浸泡疫苗免疫多组合佐剂及其应用和使用方法。
技术介绍
我国养殖鱼类产量据世界首位，但鱼类的疾病防治技术研发速度较慢，开发的渔 用疾病防治产品不能满足生产的需求，特别在渔用疫苗开发与应用方面，目前可供渔业生 产上选择使用的产品不多。因此养殖中鱼类细菌性疾病治疗过多依靠投喂抗生素，其结果 是长期的应用抗生素不仅会降低水产品的质量，还会导致细菌的耐药性增强，给以后的疾 病控制增加难度。国外在鱼类疾病控制方面已普遍采用疫苗免疫的方法，包括注射用疫苗、 浸泡用疫苗及口服疫苗等。国内的鱼用疫苗产品制剂种类不多，在鱼类疫苗研究方面多侧 重于注射用疫苗。鱼类注射用疫苗对疾病预防效果明显，但注射免疫工作量大、工作效率 低，且会对鱼体造成伤害。而鱼类浸泡用疫苗不存在上述缺点，但单纯的使用疫苗浸泡效果 不佳。 目前，有关鱼类浸泡免疫用疫苗产品因受浸泡免疫效果较差的限制，开发的产品 不多。国内已开发的鱼类浸泡疫苗佐剂有莨菪碱、葡聚糖、MS1312，试验证实，使用后免疫 保护率均不理想。而国外的鱼类浸泡免疫佐剂多为保密配方。基于以上现状，我国的鱼类 浸泡疫苗研发速度处于缓慢发展状态，限制阻碍了产业的发展。因此提供鱼类浸泡疫苗佐 剂，提高鱼类浸泡疫苗效果，对推动水产养殖用疫苗制剂产业的快速发展是非常必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是为鱼类浸泡用疫苗提供一种高效的多组合免疫佐剂。 鱼类选用浸泡疫苗免疫，不仅操作方便节省时间，而且相对于注射免疫对鱼的损 伤小，因此鱼类选用浸泡疫苗免疫是一种最佳的免疫方案。但选用浸泡疫苗免疫时，在通 常不加浸泡疫苗佐剂或特异免疫增强剂的情况下，鱼体仅仅通过鳃部接触疫苗抗原，身体 表面其他的可以激发免疫反应的部位多被体表的粘液所覆盖，导致可呈递疫苗抗原的细胞 不能有效接触到疫苗抗原，因此使用能够去除鱼体粘液的佐剂成分，可以提高鱼类浸泡疫 苗免疫的效果。研究经过试验研究发现，N-乙酰半胱氨酸(简称NAC)、曲拉通X-100(即 TRIT0NX-100)具有溶解鱼体表粘液的能力，皂角苷具有提高鱼类粘液免疫力与细胞免疫的 功效，而消旋山莨菪碱(又称654-2)可使鱼体肌肉松弛，易于疫苗抗原向体内的渗入。四 种佐剂通过组合既解决了鱼体粘液阻止疫苗抗原接触鱼体抗原呈递细胞的问题，又通过皂 角苷提高了鱼体粘液免疫与细胞免疫力，同时654-2使鱼体肌肉松弛，加强了抗原渗透鱼 体的效果。该四种佐剂组合有效提高了鱼类浸泡疫苗免疫效果，使用证实具备佐剂的功能， 且安全试验证实在使用浓度范围内对鱼类及环境安全。因此确定NAC、TRITON X-100、皂角 苷、654-2佐剂组合为高效鱼用浸泡疫苗免疫多组合佐剂。 因此，本专利技术鱼用浸泡疫苗多组合佐剂包括NAC、 TRITON X-100、皂角苷和654_2，其中NAC、TRIT0N X-100、皂角苷和654-2的使用浓度范围分别为0. l_10mg/L、0. l-10mg/L、 0.l-50mg/L、l-60mg/L。本专利技术的浓度分别在0. l-10mg/L、0. l_10mg/L、0. 1-50mg/L、l_60mg/L的NAC、 TRIT0NX-100、皂角苷和654-2免疫多组合佐剂，应用于包括海水和淡水鱼类的浸泡疫苗中 协同作用达到高效免疫效果。 本专利技术的使用方法如下 (1)首先选用体表完好健康的待免疫鱼类，体重应在每尾2g以上； (2)将待免疫的鱼移入浓度范围均为0. l-10mg/1的NAC、 TRITON X-100混合养殖用水溶液中，预浸泡l-20min，之后加入浓度0. l-50mg/L的皂角苷及待用疫苗，浸泡l-20min，再向疫苗浸泡液中加入浓度l-60mg/L的654-2待l-10min即完成免疫。本专利技术的积极效果在于用NAC、 TRITON X-100、皂角苷、654-2多组合制剂作为疫苗组合佐剂后可以显著提高疫苗的免疫效果，效果显著好于单一佐剂；使用方法简便，成本较低，使用安全，对鱼的存活率与生长速度没有影响，而且不需要额外的设施与工序，对环境及操作人员同样无害。具体实施例方式本专利技术鱼用浸泡疫苗多组合佐剂其特征在于作为鱼类浸泡疫苗的多组合佐剂包 括，NAC、 TRIT0NX-100、皂角苷和654-2，其中NAC、 TRIT0NX-100、皂角苷和654-2的使用浓 度范围分别为0. l-10mg/L、0. l-10mg/L、0. l-50mg/L、l-60mg/L。 上述的N-乙酰半胱氨酸、曲拉通X-100、皂角苷、消旋山莨菪碱的纯度优于或相当 于化学纯级。本专利技术的浓度分别在0. l-10mg/L、0. 1-10mg/L、0. l-50mg/L、l-60mg/L的NAC、 TRIT0NX-100、皂角苷和654-2免疫多组合佐剂，应用于包括海水和淡水鱼类的浸泡疫苗中 协同作用达到高效免疫效果。 本专利技术的使用方法如下 (1)首先选用体表完好健康的待免疫鱼类，体重应在每尾2g以上； (2)将待免疫的鱼移入浓度范围均为0. l-10mg/1的NAC、 TRIT0NX-100混合养殖 用水溶液中，预浸泡l-20min，之后加入浓度0. l-50mg/L的皂角苷及待用疫苗，浸泡免疫 l-20min，再向疫苗浸泡液中加入浓度l-60mg/L的654-2维持l-10min即完成免疫。为了 保证免疫效果，浸泡时水中溶解氧保持7mg/L以上，温度变化控制在士2t:内。完成浸泡免 疫后，小心将鱼移入养殖池进行养殖即可。本专利技术中NAC、 TRIT0N-100的使用浓度范围均为0. 1-10mg/L，浸泡时间均为 3-50min ;皂角苷的浓度范围为0. l-50mg/L，浸泡时间2-30min ;645-2的浓度范围为 l-60mg/L，浸泡时间l-10min。并且适用于海水鱼类、淡水鱼类及半咸水鱼类。 以下通过实施例对本专利技术作进一步说明。 实施例1 :应用本专利技术的浓度分别为0. lmg/L、0. lmg/L、50mg/L、lmg/L的NAC、 TRITON X-100、皂角苷、654-2多组合佐剂和灭活鳗弧菌(Vibrio. Anguillarum)疫苗对牙 鲆浸泡免疫 1材料 (1)试验用鱼及养殖管理选用体重5g的健康牙鲆，试验前暂养1周，试验用海水 稳定20-23°C，PH8. 1-8. 2，盐度30，试验期间投喂配合饵料，日投喂2次，24小时连续充气，流水养殖。 (2)疫苗制备将V. anguillarum接种至2216E液体培养基，28 。C培养24h ; 4t:下4000rpm离心20min，收集菌体；将收集的菌体置于灭菌的PBS， pH 7.2中，制成 1.0X108cells/mL的弧菌悬液，0. 5X甲醛28t:下灭活48h后为试验用疫苗，4t:储存；同时 将灭活后的菌体接种于TSB固体平板，置2『C下恒温培养24h、48h，确定无菌落长出。 (3)浸泡免疫佐剂NAC、 TRIT0NX-100、皂角苷、654-2，使用浓度分别为0. lmg/L、 0. lmg/L、50mg/L、lmg/L。 2试验方法 (1)试验分组试验设注射免疫组、无佐剂疫苗浸泡免疫组、佐剂+疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鱼用浸泡疫苗多组合佐剂，其特征在于上述的多组合佐剂分别是Ｎ－乙酰半胱氨酸、曲拉通Ｘ－１００、皂角苷和消旋山莨菪碱的四种佐剂组合，其中Ｎ－乙酰半胱氨酸、曲拉通Ｘ－１００、皂角苷和消旋山莨菪碱的使用浓度分别为０．１－１０ｍｇ／Ｌ、０．１－１０ｍｇ／Ｌ、０．１－５０ｍｇ／Ｌ和１－６０ｍｇ／Ｌ。

【技术特征摘要】
一种鱼用浸泡疫苗多组合佐剂，其特征在于上述的多组合佐剂分别是N-乙酰半胱氨酸、曲拉通X-100、皂角苷和消旋山莨菪碱的四种佐剂组合，其中N-乙酰半胱氨酸、曲拉通X-100、皂角苷和消旋山莨菪碱的使用浓度分别为0.1-10mg/L、0.1-10mg/L、0.1-50mg/L和1-60mg/L。2. 根据权利要求1所述的鱼用浸泡疫苗多组合佐剂，其特征在于上述的N-乙酰半胱氨 酸、曲拉通X-100、皂角苷和消旋山莨菪碱的纯度优于或相当于化学纯级。3. 权利要求1所述的鱼用浸泡疫苗多组合佐剂的使用方法，其特征在于(1) 首先选用体表完好健康的待免疫鱼类，体重在每尾2...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秀华，黄倢，王玉娟，赵伟伟，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]