本发明专利技术涉及肿瘤转移相关基因骨桥蛋白的多态性和单体型构建及其应用，具体涉及一种用于预测原发性肝癌病人预后的试剂盒，由纯化系统、扩增系统、单核苷酸多态性位点检测系统、５’→３’引物序列，３’→５’引物序列及测序引物组成。本发明专利技术还提供了一种肿瘤转移相关基因骨桥蛋白的单体型。本发明专利技术的检测试剂盒简便、快速且经济实用。对原发性肝癌病人预后进行评估，并及时采取综合手段干预，提高病人远期生存率，改善预后，方便于临床应用，为临床上进一步确定个体化治疗方案提供了有效的依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一促癌基因骨桥蛋白的单体型及用于预测原发性肝癌病人预后的试剂盒， 属于基因工程领域。
技术介绍
现有技术公开了骨桥蛋白基因与原发性肝癌(h印atocellular carci扁a， HCC)复 发转移相关。骨桥蛋白(Osteopontin， 0PN)，又称Secreted phosphoprotein I， SPPI; Bone sialoprotein I， BNSP或BSP I; Early T-lymphocyte activation-1 ， ETA-1。它最 初由Senger于1979年在转化的恶性上皮细胞中发现的一种分泌性的非胶原磷蛋白。具有趋 化因子样活性，属于SIBLING家族成员。在人、鼠、猪、牛、鸡等不同物种中均表达骨桥 蛋白，而且不同物种的骨桥蛋白cDNA均含有高度一致性序列包括氮端、碳端、凝血酶 作用位点(the thrombin cleavage site, RSK)、甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨 酸(GRGDS)序列。人骨桥蛋白(hOPN)是一种磷酸化、带负电荷、具有亲水性的酸性分泌糖 蛋白，由一个单一基因编码，定位于染色体4ql3位点上，含有7个外显子和6个内含子，延 伸至大约8千碱基对核昔酸序列，编码314个氨基酸，广泛存在于骨、牙质、牙骨质、软骨、 肾脏、血管等不同组织，在巨噬细胞、淋巴细胞和乳腺中特异的上皮细胞中发挥活性；参 与骨组织的矿化与重建、动脉粥样硬化、抗感染、免疫调节、缺血-再灌注损伤等过程。 近年来，骨桥蛋白与肿瘤的发生发展，特别是它与肿瘤转移的关系日益引起人们的关注。 骨桥蛋白通过与不同的整合素和CD44受体相互作用调节肿瘤相关信号通路，阻断细胞周 期，抑制细胞凋亡，促进细胞存活、基质降解和重塑、细胞迁移、免疫逃逸和血管形成， 最终导致肿瘤的发生、发展。单核苷酸多态性(SNP)是在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的一种DNA序 列多态性，是人类基因组中最常见的遗传变异，为第三代分子遗传标记。因为单个单核苷 酸多态性本身的功能有限、利用单个位点单核苷酸多态性分析评价骨桥蛋白基因作用是不 够全面的，它提供的信息量也较少。已有研究发现，由于单核苷酸多态性之间存在连锁不 平衡，位于同一条染色体上相邻的单核苷酸多态性等位基因往往倾向于同时出现，并以一 个整体遗传给后代。而这些位于一条染色体特定区域的一组相互关联并倾向于以整体遗传 给后代的单核苷酸多态性的组合即为单体型。它决定了基因的功能单位和人群遗传变异的内在特征。单体型的存在可以极大地减少疾病关联研究的工作量，在肿瘤侯选基因研究具有重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一促癌基因骨桥蛋白的单体型及用于预测原发性肝癌病人预后 的试剂盒。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案是提供一种用于预测原发性肝癌病人预后的试 剂盒，其特征在于，由纯化系统、扩增系统、单核苷酸多态性位点检测系统、5' —3'引 物序列，3' —5'引物序列及测序引物组成；其中，纯化系统由蛋白酶K、苯酚、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸、核糖 核酸酶和无水乙醇组成；扩增系统由脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、胸腺嘧啶核苷二磷酸、高保真酶、水、聚合酶链式反应缓冲液、氯化镁、模板DNA组成；单核苷酸多态性位点检测系统由DNA多聚酶、腺苷三磷酸、荧光素酶、腺苷三磷酸双 磷酸酶、腺苷酰硫酸和荧光素组成；5 ， 一 3' 引物序列为 CAGAAATGCTGCCATCGTGTG 、 ATAGGTAGGCTGGGCGATTT 、 ATAGGTAGGCTGGGCGATTT和TGAATGCCCATCCCGTAA;3， 一 5' 引物序列为 ACATACCCGCATAAGCGTGTC 、 GAGCCAGAAGGCTATTGTTCA 、 GAGCCAGAAGGCTATTGTTCA和ATGAGGTTTTCTGCCACTGC;测序引物为GAGTAAACTACAGTAAATCC 、 CTCTCAAGCAGTCATCC 、 AAAGGACAGAGGCAAGT和 ATTGTGTGTGTGCGTT。所述试剂盒配合骨桥蛋白单体型构建软件系统使用。本专利技术还提供了一种肿瘤转移相关基因骨桥蛋白的单体型，按SNP在染色体上的位置 顺序依次为rs 2728127 (A/G) (-1748)、 rs 2853744 (G/T) (-616)、 rs 11730582 (T/C) (-443)、 rsl1439060 (G/-) (-155)，所述的位置顺序中的rs 2728127、 rs 2853744、 rs 11730582、 rsl1439060，顺序以1-2-3-4表示，其中11439060的-示无插入，分别为GTTG、 AGT-、 AGC-、 ATT-、 AGCG、 ATTG、 GTT-、 AGTG、 ATC-、 GGTG和GTCG (共占99. 1%)。本专利技术通过对510例HCC病人的肿瘤转移相关基因OPN启动子区域目前所有的SNP位 点检测，对该基因进行单体型构建。本专利技术构建的OPN基因单体型有如下11种，按SNP 在染色体上的位置顺序依次为rs 2728127 (A/G) (-1748)、 rs 2853744 (G/T) (-616)、 rs 11730582 (T/C) (-443)、 rsl1439060 (G/-) (-155)，所述的位置顺序中的rs 2728127、 rs 2853744、 rs 11730582、 rsl1439060，顺序以1-2-3-4表示，其中11439060的-示无插入，分别为GTTG、 AGT-、 AGO、 ATT—、 AGCG、 ATTG、 GTT-、 AGTG、 ATC-、 GGTG禾Q GTCG (共占99. 1%)。本专利技术通过对510例原发性肝癌病人的肿瘤转移相关基因骨桥蛋白启动子区域目前所 有的单核苷酸多态性位点检测，对该基因进行单体型构建，具体实验步骤如下1、 选择病人本专利技术对2002年4月至2006年10月间在复旦大学肝癌研究所进行肝切除手术的510 例原发性肝癌病人研究单体型与肝癌转移复发的关系，在510例原发性肝癌病人基础上， 选取了 351例具有五年随访资料的原发性肝癌病人，探讨单核苷酸多态性基因型、单体型 与术后DFS (术后复发)以及生存的关系。将冰冻的肝癌及癌周组织放于液氮中，砸成粉 末状，应用DNA提取纯化系统，提取组织中基因组DNA,使用DU800紫外分光光度计测定 DNA的260吸光度值(A260)和260/280的吸光度比值(1. 8-2. 0)，以评估其浓度和质量， 琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。符合定量检测要求的样本置于-8(TC保存备用。2、 单核苷酸多态性检测采用焦磷酸测序方法(Pyrosequencing 96, PSQ 96)，对目前美国国立生物技术信息 中心上(NCBI)已经登录的单核苷酸多态性多态性数据库中骨桥蛋白基因的所有15个单 核苷酸多态性位点(rs 2853746、 rs29001511、 rs 2728127、 rs3891314、 rs 2853744、 rs 11730582、rs本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于预测原发性肝癌病人预后的试剂盒，其特征在于，由纯化系统、扩增系统、单核苷酸多态性位点检测系统、５’→３’引物序列，３’→５’引物序列及测序引物组成； 其中，纯化系统由蛋白酶Ｋ、苯酚、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸、核糖核 酸酶和无水乙醇组成； 扩增系统由脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、胸腺嘧啶核苷三磷酸、高保真酶、水、聚合酶链式反应缓冲液、氯化镁、模板ＤＮＡ组成； 单核苷酸多态性位点检测系统由ＤＮＡ多聚酶、腺苷三磷酸、荧光素酶和腺 苷三磷酸双磷酸酶和底物混合物组成，所述底物混合物由腺苷酰硫酸和荧光素组成； ５’→３’引物序列为ＣＡＧＡＡＡＴＧＣＴＧＣＣＡＴＣＧＴＧＴＧ、ＡＴＡＧＧＴＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＡＴＴＴ、ＡＴＡＧＧＴＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＡＴＴＴ和ＴＧＡＡＴ ＧＣＣＣＡＴＣＣＣＧＴＡＡ； ３’→５’引物序列为ＡＣＡＴＡＣＣＣＧＣＡＴＡＡＧＣＧＴＧＴＣ、ＧＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＣＴＡＴＴＧＴＴＣＡ、ＧＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＣＴＡＴＴＧＴＴＣＡ和ＡＴＧＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＣＣＡＣＴＧＣ； 测 序引物为ＧＡＧＴＡＡＡＣＴＡＣＡＧＴＡＡＡＴＣＣ、ＣＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧＴＣＡＴＣＣ、ＡＡＡＧＧＡＣＡＧＡＧＧＣＡＡＧＴ和ＡＴＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＴ。...
【技术特征摘要】
1、一种用于预测原发性肝癌病人预后的试剂盒，其特征在于，由纯化系统、扩增系统、单核苷酸多态性位点检测系统、5’→3’引物序列，3’→5’引物序列及测序引物组成；其中，纯化系统由蛋白酶K、苯酚、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸、核糖核酸酶和无水乙醇组成；扩增系统由脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、胸腺嘧啶核苷三磷酸、高保真酶、水、聚合酶链式反应缓冲液、氯化镁、模板DNA组成；单核苷酸多态性位点检测系统由DNA多聚酶、腺苷三磷酸、荧光素酶和腺苷三磷酸双磷酸酶和底物混合物组成，所述底物混合物由腺苷酰硫酸和荧光素组成；5’→3’引物序列为CAGAAATGCTGCCATCGTGTG、ATAGGTAGGCTGGGCGATTT、ATAGGTAGGCTGGGCGATTT和TGAATGCCCATCCCGTAA；3’→5’引物序列为ACATACCCGCATAAGCGTGTC、GAGCCAGAAGGCTATTGTTCA、GAGCCAGA...
【专利技术属性】
技术研发人员：董琼珠，钦伦秀，贾户亮，赵越，闫兆伟，张晓飞，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，复旦大学生物医学研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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