γ－ｔｍｔ和ｖｔｅ３基因共转化提高植物中维生素Ｅ含量的方法技术

本发明专利技术属生物技术领域，涉及一种γ－ｔｍｔ和ｖｔｅ３基因共转化提高植物中维生素Ｅ含量的方法。本发明专利技术从植物中克隆γ－ｔｍｔ和ｖｔｅ３基因，构建含所述ＤＮＡ分子的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将γ－ｔｍｔ和ｖｔｅ３基因同时导入植物并再生出植株，ＰＣＲ检测外源目的基因γ－ｔｍｔ和ｖｔｅ３的整合情况，高效液相色谱－紫外光检测器测定植物中维生素Ｅ含量，筛选获得维生素Ｅ含量提高的转基因植株。获得的转基因植物叶片中维生素Ｅ的含量显著提高，最高达到非转化对照植株的１．３倍，并且，α－生育酚在生育酚总量中所占的比例得到了显著的提高，由原来的８６％提高到９９．５％以上。本发明专利技术对提高植物营养价值具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，涉及提高维生素E(生育酚)含量的方法，特别是一种双 关键酶基因Y -tmt和vte3共转化提高植物中维生素E含量的方法。
技术介绍
现有技术公开了维生素E是一种脂类维生素，其天然产物依结构的不同分为 八种类型，分别是a 、 P 、 Y 、 S -生育酚(tocopherol)禾P a 、 |3 、 y 、 S -生育三烯酚 (tocotrienol)，其中a -生育酚的生物活性最高，被认为是维生素E的主要活性成分。 医学研究表明，维生素E不仅仅与生殖系统有关，而且与中枢神经系统、消化系 统、心血管系统和肌肉系统的正常代谢都有密切关系(Traber and Sies， 1996)。其功能体 现在如下方面维生素E参与细胞膜的构建和维持，是动物和人体内重要的抗氧化物质。维 生素E是治疗冠心病、动脉粥样硬化等心脑血管疾病的重要辅助性药物，有助于降低血脂 和血胆固醇含量，抗凝血、抗氧化并且消除自由基，从而起到预防及治疗血管栓塞的作用。 维生素E对于提高机体免疫能力有着重要的影响，具有抗衰老的功能，可以消除细胞色素 沉淀，改善皮肤弹性，减弱性腺萎縮，因而在大量保健品和美容用品中广泛使用。维生素E 可以预防和治疗多种妇科疾病，治疗早产儿溶血性贫血和蚕豆病，治疗营养不良儿童的巨 幼红细胞性贫血。维生素E可以促进胆汁分泌、胆管形成和胆红素分泌，对急慢性肝炎和肝 硬化有着治疗作用。维生素E可以预防癌症发生，对于癌症患者的治疗也有重要的辅助作 用。 维生素E对于人类和动物健康有重要作用，但维生素E的合成途径只存在于绿色 光合植物中，包括低等单细胞植物蓝藻和高等植物；人体和动物体内不存在维生素E合成 途径，故而日常营养所需的维生素E摄取自绿色植物，特别是各种油类作物的种子，以及由 种子所榨取的植物油。 直接由植物油脱臭馏出物中获得的生育酚混縮液的生物活性很低，a -生育酚的 含量较低。工业生产维生素E主要是以上述生育酚混縮液为原料，经过半合成法，将其中的 非a-生育酚成分转变为a-生育酚。但是成本较高，而且产生的a-生育酚消旋性与天然 a-生育酚不同，活性也低于天然a-生育酚。因此，提高植物天然生育酚含量及其a-生 育酚比例有着十分重要和现实的应用价值。 随着近年来植物基因组学的发展，DellaPe皿a于1999年提出了营养基因组学 (nutritional genomics)的概念，即充分的利用基因组学的研究成果，分离植物营养代谢 途径的关键酶基因，解析植物微量营养素代谢途径，深入了解代谢途径的调控方式，从而利 用代谢工程的方法和手段改良作物品质，提高作物营养价值(DellaPenna，《科学》，1999年 285巻375-379页)。基于营养基因组学的观点和现实情况的调研，对维生素E的生物合成 途径研究的主要目标有二，其一是提高维生素E的整体含量，其二是改变维生素E的类型组 成比例，提高其中a-生育酚的组成比例。为达到这种目标，必须对维生素E的生物合成途径及其调控进行研究。 基于基因组学的基础，维生素E合成途径的基因分离、克隆和功能性研究已经取 得了突破性的进展。人们已经初步完成了对参与维生素E合成途径关键基因的分离和功能 验证工作，初步分析了维生素E(生育酚)合成途径概貌。 维生素E(生育酚)合成途径主要由以下五个步骤组成。(1)4-羟苯丙酮酸(HPP) 在4-羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)的催化下，生成尿黑酸(HGA) (Norriset al. ， 1998); (2)尿黑酸在尿黑酸植基转移酶(HPT)催化下，与植基二磷酸(PDP)发生縮合，生成2-甲 基-6-植基-苯醌(Collakova and DellaPenna， 2001) ; (3) 2_甲基-6-植基-苯醌在甲基植 基苯醌甲基转移酶(MPBQ MT)的催化下，生成2，3-二甲基-6-植基-苯醌(van Eenennaam et al. ，2003) ; (4) 2， 3_ 二甲基_6_植基-苯醌在生育酚环化酶(TC)的催化下，生成Y-生 育酚(Porfirova et al. ，2002) ;(5) Y -生育酚在Y-生育酚甲基转移酶(Y-TMT)的催化 下，生成a-生育酚。 现有技术中Y-生育酚甲基转移酶(Y -tocopherol methyltransferase， Y-TMT)和甲基植基苯醌甲基转移酶(2-methyl-6-phytylplastoquinol methyltransferases， MPBQ MT，编码这一蛋白的基因为vte3)是生育酚合成途径中的关键 酶。采用基因工程手段，用关键酶y -TMT与MPBQ MT的基因y -tmt和vte3共转化植物， 将增加维生素E的合成，从而获得维生素E高产的转基因植株，为提高植物营养价值提供了 一条新途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种Y -tmt和vte3共转化提高 植物中维生素E含量的方法。本专利技术涉及到关键酶基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检 测、生育酚提取及含量测定等生物技术操作，建立了稳定提高植物中生育酚含量的方法，为 利用基因工程技术提高重要农作物和经济作物中维生素E的含量奠定了坚实的基础。 本专利技术的目的通过以下技术方案实现 从植物中克隆Y -tmt和vte3基因，构建含所述DNA分子的共转化植物表达载体， 用根癌农杆菌介导，将Y-tmt和vte3基因同时导入植物并筛选得到纯系植株；PCR检测外 源目的基因Y -tmt和vte3的整合情况，高效液相色谱_紫外光检测器(HPLC-UVD)测定植 物中维生素E(生育酚)含量，筛选获得维生素E含量显著提高的转基因植株。 本专利技术方法包括下述步骤 (1)采用基因克隆方法获得植物生育酚合成途径关键酶基因Y -tmt和vte3 ; (2)把Y-tmt和vte3基因可操作性的连接于表达调控序列，形成含Y-tmt和 vte3基因的植物表达载体； (3)将含有Y -tmt和vte3基因的植物表达载体转化根癌农杆菌(为市场有公开 出售的生物材料，可以从多家公司如澳大利亚CAMBIA公司获得)，获得用于转化植物的含 有Y -tmt和vte3基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株； (4)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化植物，获得经PCR检测的转基因植株； (5)对获得的转基因植物中的维生素E含量进行HPLC-UVD测定，筛选获得维生素 E含量显著提高的转基因植株。4 所述的经PCR检测的转基因植株是指，分别设计合成Y -tmt和vte3基因的检测 引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性植株即为转基因植株。 所述的HPLC-UVD测定植物中维生素E含量，方法如下色谱柱C_18反相硅胶柱， 流动相为甲醇水，甲醇水的体积比为98 : 2，柱温为3(TC，流速l. OmL/min，进样量 30 ii L，紫外光检测器检测波长292nm。 本专利技术的Y -tmt和vte3基因共转化提高植物中维生素E含量的方法，采用基因 工程方法，将关键酶基因Y -tmt和vte3导入植物中，获得了维生素E含量显著提高的转基 因植株，转基因植株中生育酚的总量(15.8pmol/mg FW)是非转基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种γ－ｔｍｔ和ｖｔｅ３基因共转化提高植物中维生素Ｅ含量的方法，其特征在于，从植物中克隆γ－ｔｍｔ和ｖｔｅ３基因，构建含所述ＤＮＡ分子的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将γ－ｔｍｔ和ｖｔｅ３基因同时导入植物并筛选得到纯系植株，ＰＣＲ检测外源目的基因γ－ｔｍｔ和ｖｔｅ３的整合情况，高效液相色谱－紫外光检测器测定植物中维生素Ｅ含量，筛选获得维生素Ｅ含量提高的转基因植株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙小芬，李殷，唐克轩，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]