一种利用植物油体蛋白表达系统生产人胰岛素样生长因子－Ｉ的方法技术方案

本发明专利技术属基因工程技术领域，提供了一种利用植物油体表达系统表达和纯化人胰岛素样生长因子－Ｉ（ｈｕｍａｎ？ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ？ｇｒｏｗｔｈ？ｆａｃｔｏｒ？Ｉ，ｈＩＧＦ－Ｉ）的方法。本发明专利技术方法按照植物密码子的偏爱性设计合成了人胰岛素样生长因子－Ｉ基因，将所述人胰岛素样生长因子－Ｉ基因与油体蛋白基因融合，构建成用种子特异性表达启动子驱动的植物表达载体，将该载体转化受体植物，在转化植株种子中高效表达具有生物学活性的人胰岛素样生长因子－Ｉ。本方法得到的胰岛素样生长因子－Ｉ可应用于儿童ＩＧＦ－Ｉ不足和生长激素（ＧＨ）基因缺失的治疗以及其他临床和实验室的研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属基因工程
，涉及一种转基因植物中表达外源蛋白的方法。具体地，本专利技术涉及一种利用植物油体表达系统在植物种子中高效表达人胰岛素样生长因子-I 的方法。
技术介绍
胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)，又称类胰岛素生长因 子，是一种多功能细胞增殖调控因子。1978年Humbel等首次纯化到两种形式的IGF， IGF-I 和IGF-II，因其化学结构与胰岛素原(proinsulin)类似而得名。其中IGF-I对细胞正常生 长、胚胎发育、神经生长、肿瘤免疫、能量代谢等方面起着十分重要而广泛的作用，IGF-I生 物学作用广泛，其生物学效应主要有促有丝分裂作用(如促进细胞分化，剌激RNA、DNA的合 成和细胞增殖)和类胰岛素原作用(如抑制肝糖释放，增加葡萄糖摄取和转化，抑制脂肪分 解，减少游离脂肪酸和氨基酸的血液浓度，促进脂质和糖元以及蛋白质的合成)。IGF在临 床治疗上的应用价值正在被广泛的认识和研究，目前临床研究表明IGF在侏儒症、骨质疏 松、抗胰岛素糖尿病、出血性溃疡症及烧伤和末梢神经损伤等许多疾病治疗中都具有重要 的应用价值。用大肠杆菌生产的重组人IGF-I已经被批准应用于儿童IGF-I不足和生长激 素(GH)基因缺失的治疗。 随着对IGF-I、 IGF-I受体和IGF-I结合蛋白(IGFBP)研究的深入，IGF-I在临床 疾病治疗方面的潜在应用价值将被进一步开发，社会对IGF-I的需求也越来越大。但天然 IGF-I的纯化存在很多困难，因此利用基因工程的方法获得IGF-I有着广阔的研究及生产 前景。随着基因工程技术的发展，人们已经尝试在多个表达系统中生产IGF-I，这些系统包 括大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞等。这些方法都存在一定的局限性，如大肠杆菌中表达的 IGF-I难以形成正确的二硫键，往往以包涵体的形式进行表达，需要经过繁琐的复性和纯化 过程才能得到有活性的产品。而用哺乳动物细胞生产则因为需要昂贵的设备和培养基而导 致过高的生产成本。 植物转基因技术的出现给重组蛋白表达系统提供了一个新的选择，从1983年首 次获得转基因植物至今，植物基因工程的研究和应用取得了飞速发展。近年来，人们发现利 用植物作为重组蛋白的表达宿主具有很多优势，用植物生产药用蛋白越来越受到了人们的 重视，成为国际上植物基因工程发展的一个新趋势。目前已经有多个重要药用蛋白在植物 中表达成功，如水蛭素、胰岛素、干扰素、人血清白蛋白、人表皮生长因子等以及多种抗体和 疫苗，为利用植物作为生物反应器生产药用蛋白打下了基础。 在众多的利用植物表达外源药用蛋白的策略中，油体蛋白表达系统在外源蛋白的 表达和纯化上有巨大的应用潜力，近年来备受关注。油体蛋白是油菜、玉米、拟南芥等植物 种子中的一类丰富的存在于储存细胞器油体表面的结构蛋白，含量达到种子总蛋白的2 4%。从结构来看，油体蛋白可以分为三个部分，物种间保守性较高的中间疏水域和N-端、3c-端的两亲性结构域，疏水域对油体蛋白正确定位至油体的功能非常重要，而油体蛋白N-端或C-端氨基酸序列的改变不会影响油体蛋白在油体上的定位。1994年人们在油菜 中表达油体蛋白和e-葡糖醛酸糖苷酶(13-glucuronidase, GUS)的融合蛋白获得成功， 融合蛋白正确定位至油体上，且蛋白能在种子中长期储存或提取后放置3-4周仍然能保持 活性，证实了油体蛋白作为载体表达外源蛋白的可行性。有关水蛭素(hirudin)、胰岛素 (insulin)等均在该系统中表达取得成功。 在重组蛋白表达系统中，重组表达的蛋白通常需要从表达的宿主中提取出来并进 行纯化后才能得到应用，特别是对于药用蛋白，蛋白的纯化在整个生产过程中要占到80 % 以上的成本，因此纯化策略的选取在植物作为生物反应器的过程中是一个非常重要的因 素。在植物油体蛋白表达系统中，利用油体亲脂疏水并且密度比水小的性质，可以通过"悬 浮_离心"(flotation-centrifugation)的方法方便地将油体与其他多数细胞组分分离开 来。经过多次洗涤后，油体蛋白及与其融合的目标蛋白也在油体中得到富集和纯化。总之， 与其他植物表达系统相比，油体蛋白表达系统具有重组蛋白表达量高、目标蛋白稳定性好、 蛋白提取纯化方便等优势，同时，油体蛋白表达系统的宿主植物主要是油菜、大豆、玉米等 农作物，这些作物种植和种子加工技术都在传统的食品工业中得到发展，而且分离目标蛋 白种子中的油等其他部分仍然可以利用，在这些作物的种子中表达外源蛋白大大增加了农 产品的附加值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用植物油体表达系统生产人胰岛素样生长因 子-I (human insulin-like growth factor I， hIGF-1)的方法，利用这种方法得到的胰岛 素样生长因子-I可以应用于儿童IGF-I不足和生长激素(GH)基因缺失的治疗以及其他临 床和实验室的研究。 本专利技术首先按植物密码子的偏爱性设计、通过基于PCR的基因合成方法 (PCR-based gene synthesis)人工合成了 hIGF-1基因的全序列，该序列如SEQ IDNO. 1所 示； 进一步，本专利技术构建了含有油体蛋白基因与上述hIGF-I基因的融合蛋白基因的表达载体，所述的油体蛋白基因为拟南芥18. 5kDa油体蛋白基因，两个基因之间设计的编码烟草蚀刻病毒蛋白水解酶(Tobacco etch virus protease, TEVP)的识别序列的核苷酸序列，表达载体所选用的启动子为拟南芥18. 5kDa油体蛋白的启动子； 然后，将上述表达载体转入根癌农杆菌中，通过农杆菌介导法转化植株，将带有油体蛋白启动子、油体蛋白-胰岛素样生长因子融合基因及rbsS polyA终止子的表达盒整合到植物基因组中，筛选和培养出带有上述融合基因的转基因植株，进一步育种得到后代不发生分离的纯合植株，该植株所产生的种子中含所述hIGF-I蛋白；并且，该植株的性状能长期稳定遗传到下一代，所述的hIGF-I具有正确的生物学活性。 具体地，本专利技术包括如下的步骤 (1)按照植物密码子偏爱性设计和合成hIGF-I基因； (2)从拟南芥基因组中分离得到拟南芥18. 5kDa油体蛋白基因及其启动子； (3)将hlGF-I基因核苷酸序列连接到油体蛋白基因核苷酸序列的3'端，将整个融合蛋白基因置于油体蛋白启动子下游，以植物表达载体pHB为骨架构建hIGF-I的油体蛋白 表达载体； (4)将步骤(3)所得到的植物表达载体转化至根癌农杆菌菌株GV3101中； (5)用步骤(4)中所得到的含有hIGF-I的油体蛋白表达载体的农杆菌转化适当的 宿主植物(如拟南芥、油菜)； (6)通过抗性和PCR的方法筛选转基因阳性植株； (7)筛选hIGF-I表达量高的植株，培育数代直至性状不发生分离； (8)将步骤(7)所得到的转基因植株种子经过粉碎、悬浮-离心法纯化得到油体蛋白_人胰岛素样生长因子-I的融合蛋白； (9)用人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y检验步骤(8)中所得到的蛋白的活性。 所述人hIGF-I基因是指，人工合成的经过植物偏爱密码子优化的hIGF-I基因序 列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在植物种子中高效表达融合基因的载体，其特征在于，该载体上的表达盒自５′至３′依次包含以下元件：油体蛋白启动子或种子特异表达启动子、外源目标蛋白基因和油体蛋白基因的融合基因、终止子序列ｒｂｓＳ　ｐｏｌｙＡ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙小芬，李维，游晓慧，唐克轩，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]