【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及饲料添加剂领域；具体涉及枯草芽孢杆菌n65制剂在制备大口黑鲈功能性饲料添加剂中的应用。
技术介绍
1、工厂化养殖成一直是大口黑鲈的主要养殖方式，近年来随着养殖产业的迅猛发展，鱼价逐渐下行，受国际鱼粉等原材料价格波动的影响，大口黑鲈饲料价格上涨明显，养殖户的养殖效益在逐年下降。为了追求更高的利润空间，养殖户不断提升养殖密度，加大投喂频次和投喂量，频繁地分级筛苗，减少因密度太高而出现的互残问题，以期取得更好的单位面积养殖效益。这种高密度集约化养殖，也产生了许多新的问题，例如频繁的筛苗，导致鱼苗损伤和细菌感染的风险增加，另外，高频次投喂导致鱼苗消化和代谢能力下降，容易出现肠道细菌性疾病等。为了减少损失，养殖过程需要频繁使用消毒剂和抗生素等药物，增加了养殖成本，同时也带来了药物残留问题，严重威胁到大口黑鲈产业的健康发展。为了改善大口黑鲈苗种培育技术工艺，亟需寻找一种新的功能性饲料添加剂，通过定期口服，提升大口黑鲈鱼苗的生长性能和抗病力，减少抗菌消炎药物的使用频次。
2、枯草芽孢杆菌作为饲用益生菌，不仅经常作为活菌进行饲料添加，而且其还代谢产生丰富的抗菌活性物质(如细菌素、脂肽等)，能够有效的抑制致病菌、维持肠道微生物区系平衡，从而维护动物肠道免疫，增强动物的防病能力。但是，不同来源的枯草芽孢杆菌其在高密度发酵过程中代谢产物的合成种类及表达量差异大，大大限制了其在生产实践中的功能发挥。如何高效制备高活性物质含量的枯草芽孢杆菌代谢产物，并将其有效应用于大口黑鲈饲料中，尚缺乏系统的研究和应用。
1、本专利技术通过一下技术方案实现：
2、一种功能性饲料添加剂，其特征在于，主要成分为特定株系的枯草芽孢杆菌及其活性代谢产物，主要活性代谢产物为脂肽类混合物。
3、其中所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌n65(bacillus subtilisn65)，保藏号为gdmcc no:62369，保藏日期为2022年4月11日。
4、所述功能性饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：
5、选择特定高活性的枯草芽孢杆菌菌株n65，进行纯培养；
6、在适宜的培养基中，控制温度、溶氧(do)值等条件，使菌株大量繁殖并高效产生活性代谢产物；
7、菌体灭活并收集、过滤、浓缩细胞组分与代谢产物；
8、将灭活菌体以及浓缩的代谢产物喷雾干燥后按一定比例添加载体，得到功能性饲料添加剂。
9、所述功能性饲料添加剂在大口黑鲈饲料中的应用
10、将上述步骤所得的功能饲料添加剂按饲料总量的0.1％的比例均匀混入基础饲料中，进行大口黑鲈的养殖试验。试验用鱼来自福建省淡水水产研究所南平基地自繁苗种。试验用鱼规格整齐、健康、活力良好，初始体重为38.43±3.17g。试验用饲料为加州鲈配合饲料(福建天马科技集团有限公司)，产品标准编号：q/tmjt 024-2021，产品成分分析保证值：水分≤12.0％，粗蛋白质≥53.0％，粗脂肪≥6.0％，粗纤维≤5.0％，粗灰分≤16.0％，钙≥1.0％，总磷≥1.0％，赖氨酸≥2.7％。试验在福建省淡水水产研究所实验室进行，大口黑鲈在实验室暂养3天，以适应养殖环境，暂养结束后饥饿24小时。选择规格一致、健康无病的试验鱼开始试验。设置对照组和实验组，每组设置3个平行，每个平行30尾试验鱼。每天投喂2次(9:00和16:00)，日投喂量为鱼体重的3％～5％，每天记录摄食及死亡情况，及时清除死鱼。每天吸除粪便和残饵,并更换1/3的养殖用水。试验期间，增氧设备不间断开启，溶解氧浓度为4.59～5.68mg/l，水温19.2～28.3℃，ph值7.08～7.60，氨氮浓度＜0.2mg/l，亚硝酸盐浓度＜0.1mg/l。试验周期为50天，试验结束后选取30尾试验鱼进行生长指标测定。
11、样品采集：养殖结束后进行样品采集，取样前将试验鱼饥饿24h。每个养殖桶取3尾大口黑鲈，麻醉后，用1ml注射器抽取血液，放入4℃冰箱18h后，3000-4000r离心10min分离获取血清用于生理生化检测。在冰盘中沿腹中线剖开鱼腹，取出肝脏、肠道，放于-80℃冰箱中密封存储，用于抗氧化能力和消化酶活性检测。另取3尾大口黑鲈，取出肠道放入4％多聚甲醛固定液中常温保存，用于肠道石蜡切片制作。
12、生长性能指标：试验鱼的尾绝对增重、增重率、日增重、丰满度、成活率及饲料系数分别用以下公式进行计算。
13、尾绝对增重(g)＝试验结束尾重-试验开始尾重；
14、增重率(％)＝(尾绝对增重/试验开始尾重)×100％；
15、日增重(g)＝尾相对增重/试验天数；
16、成活率(％)＝(成活尾数/总尾数)×100％；
17、摄食率(％)＝总投饵量×100/[试验天数×(试验结束总重+试验初始总重)/2]；
18、饲料系数＝总投饵量/鱼体总增重。
19、肠道消化酶活性的测定：消化酶活性测定指标包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶。将储存在-80℃的肠道组织在冰上解冻，称适量组织，用9倍生理盐水研磨，然后将研磨液3000-4000r，离心10min，取上清制备成10％的组织匀浆后，放入4℃冰箱待测。以上指标均采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测。
20、肝脏抗氧化指标测定：抗氧化能力测定指标包括超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)、过氧化氢酶(cat)、总抗氧化能力(t-aoc)。将储存在-80℃的肝脏组织在冰上解冻，称适量组织，用9倍匀浆介质研磨，然后将研磨液3000-4000r，离心10min，取上清制备成10％的组织匀浆后，放4℃冰箱待测。以上指标均采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测。
21、免疫指标测定：血清免疫指标包括谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、碱性磷酸酶(alp)、酸性磷酸酶(acp)、总蛋白(tp)、白蛋白(alb)、皮质醇(cortisol)。以上指标均采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测。
22、肠道石蜡切片制作：将固定好的试验鱼肠道从4％多聚甲醛中取出,剪切、修整好中肠用于制作石蜡组织切片；用75％的无水乙醇进行组织梯度脱水；用二甲苯透明2次；透蜡3次；组织包埋,组织块修整与切片,切片厚度为5μm；展片和烤片；苏木素-伊红染色(he染色)；中性树胶封片。用显微镜进行镜检，图像采集软件进行拍照，测定肠道褶皱数、皱襞高度、肌层厚度。
23、具体的，本专利技术提供了枯草芽孢杆菌n65制剂的以下至少一个应用：
24、(1)在制备改善大口黑鲈肠道结构的制剂中的应用；
25、(2)在制备保护大口黑鲈肝脏功能的制剂中的应用；
26、(3)在制备提高大口黑鲈骨转换率或胆汁流动的制剂中的应用；
27、(4)在制备增强大口黑鲈肝脏抗氧化能力的制剂中的应用；
28、(5)在制备提高大口黑鲈肠道消化酶活性本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.枯草芽孢杆菌N65制剂的以下至少一个应用：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌N65制剂由如下方法制备而成：
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述改善大口黑鲈肠道结构为增加肠道皱壁高度和增加肠道肌层厚度。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述提高大口黑鲈骨转换率或胆汁流动为提高了大口黑鲈血清中的碱性磷酸酶和酸性磷酸酶。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述保护大口黑鲈肝脏功能为降低血清中的谷丙转氨酶含量。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：增强大口黑鲈肝脏抗氧化能力为提高肝脏超氧化物歧化酶活性和提高肝脏总抗氧化能力。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肠道消化酶为胃蛋白酶和α-淀粉中的至少一种。
8.一种大口黑鲈功能性饲料添加剂的制备方法：具体包括如下步骤：
9.如权利要求8的制备方法，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.枯草芽孢杆菌n65制剂的以下至少一个应用：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌n65制剂由如下方法制备而成：
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述改善大口黑鲈肠道结构为增加肠道皱壁高度和增加肠道肌层厚度。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述提高大口黑鲈骨转换率或胆汁流动为提高了大口黑鲈血清中的碱性磷酸酶和酸性磷酸酶。
5.根据权利要求1所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛凌展，方文棋，张文，黄钦耿，蒋顺进，赵颖，陈宇舒，张新艳，
申请(专利权)人：福建省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：
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