【技术实现步骤摘要】
(一)本专利技术涉及一种肠道内苦味受体tas2r38激动剂快速筛选的方法。
技术介绍
0、(二)
技术介绍
1、糖尿病是一种以患者血糖长期高于标准值为特征的代谢性疾病。目前，糖尿病及其慢性并发症已成为影响人类健康和生活质量的慢性非传染性疾病。其中2型糖尿病(t2dm)主要是一种由胰岛素抵抗及胰岛素相对缺乏引起的异质性疾病，约占所有糖尿病患病比例的90％，受到更广泛的关注。
2、肠道是人体的主要吸收器官，许多口服药物均通过肠道吸收或间接作用实现其相应功效。研究证明糖尿病与肠内分泌细胞存在密切联系，如肠内分泌细胞(l细胞)可表达苦味受体，激活苦味受体可促进细胞内ca2+浓度增加，促进内源性肠促胰素glp-1的分泌，glp-1进入血液循环后可促进胰岛素的分泌，从而发挥降糖作用。临床上有许多glp-1类降糖药物，均为外源性glp-1类似物，如艾塞那肽，其在体内能够很快被二肽基肽酶-4(dpp-4)分解，半衰期非常短，常容易引起低血糖、皮肤过敏等副作用。内源性glp-1具有较好的生物兼容性，安全性较高。因此，基于肠道内苦味受...
【技术保护点】
1.一种肠道内苦味受体TAS2R38激动剂快速筛选的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)构建含苦味受体TAS2R38编码基因的重组质粒，转染宿主细胞，提取苦味受体TAS2R38膜蛋白，PBS稀释，得到膜蛋白液；(2)待测提取物溶液与膜蛋白液混匀，室温孵育60min，取样作为超滤前样品进行LC-MS检测；(3)步骤(2)孵育后的混合液超滤、离心，沉淀用PBS洗涤后加入甲醇洗涤，离心，收集沉淀，作为超滤后样品进行LC-MS检测；(4)比对超滤前后LC-MS的基峰色谱图，筛选相同出峰时间，超滤后色谱峰高于超滤前色谱峰的组分，再根据质谱图鉴定组分的化合物结构，筛选活...
【技术特征摘要】
1.一种肠道内苦味受体tas2r38激动剂快速筛选的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)构建含苦味受体tas2r38编码基因的重组质粒，转染宿主细胞，提取苦味受体tas2r38膜蛋白，pbs稀释，得到膜蛋白液；(2)待测提取物溶液与膜蛋白液混匀，室温孵育60min，取样作为超滤前样品进行lc-ms检测；(3)步骤(2)孵育后的混合液超滤、离心，沉淀用pbs洗涤后加入甲醇洗涤，离心，收集沉淀，作为超滤后样品进行lc-ms检测；(4)比对超滤前后lc-ms的基峰色谱图，筛选相同出峰时间，超滤后色谱峰高于超滤前色谱峰的组分，再根据质谱图鉴定组分的化合物结构，筛选活性高的组分，获得苦味受体tas2r38激动剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)苦味受体tas2r38编码基因核苷酸序列如seq id no.1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)重组质粒按如下步骤构建：提取小肠组织总rna，以cdna为模版，pcr扩增苦味受体tas2r38编码基因，与同样经限制性核酸内切酶bamhi和nhei酶切的pcdna3.1(+)载体连接，得到tas2r38-pcdna3.1(+)重组质粒；所述pcr引物为：f-aatttttgggacgtggtgag；r-tcagtgggtccttcatcctc。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)转染宿主细胞按如下步骤进行：1)宿主细胞的dmem培养基悬液以8.0×105/孔的密度接种至6孔板，培养过夜至细胞汇合度达到50-60％；2)将含lipo2000转染试剂的dmem培养基和重组质粒的dmem培养基各自室温孵育5min后混合均匀，室温孵育20min，加入步骤1)培养孔中，37℃、5％co2培养6h后，更换新的含体积浓度1％fbs的dmem培养基，继续培养48h，获得转染后的细胞；lipo2000转染试剂和重组质粒的比例为3μl:2μg。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)膜蛋白液按如下步骤制备：将转染后的细胞培养板用胰酶消化后，每孔加入低渗溶液，放置于碎冰中裂解20min，在4℃条件下15000g离心10min，收集沉淀，悬浮于pbs，即为膜蛋白液；所述低渗溶液组成：20mm tris-hcl，10mm ...
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