本发明专利技术提出了一种可以导致植物不开花的基因表达载体的构建方法及其培育无花植物的转基因方法。利用拟南芥控制花芽原基细胞形成的ｌｅａｆｙ基因上游启动子序列和淀粉芽孢杆菌核糖核酸水解酶基因ｂａｒｎａｓｅ构建了一个培育无花植物的基因表达载体；将该表达载体转入植物细胞后，转基因植株花原基细胞自动死亡，因而不能形成花器官、植株彻底不开花、不结实。本发明专利技术所构建的培育无花植物的基因表达载体效果好、性能稳定。可以用于改良花和果实无观赏价值、开花结实会给人们带来麻烦的园林植物，也可以用于改良花、果实和种子无经济价值的植物，培育不开花、不结实的植物品种。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业和林业生物技术植物基因工程领域。特别是一种培育无花 植物的基因表达载体的构建及其培育无花植物的基因工程方法。
技术介绍
植物在人类的生活和生存环境中发挥着极为重要的作用，但有些植物开花 结实的特卓给人类带来了许多麻烦。如悬铃木(法国梧桐)植株高大、树冠浓 密，在夏季给人们带来了荫凉，是我国广大城乡十分重要的人行道树种。但是 成年的法国梧桐大量开花、结果，果实成熟后开裂、果毛在空中飞舞，不仅污 染了环境，而且容易掉入眼睛和被吸入呼吸道，危害人们的身体健康。又如杨 树，既是我国重要的人行道树种，也是我国十分重要的造林速生树种，但每年 春夏季节，杨树开花所形成的花絮在空中漫天飞舞，同样容易被人吸入呼吸道 和掉入人的眼睛中，危害健康。在杨树造林地区，每年杨树的花絮数量多，巻 成球状或者条状，遇火即燃，常常造成火灾。又如原产东亚的观叶园林植物一 一火焰卫矛和日本小檗，因为叶色美丽而长期受到人们的喜爱和栽培，但是它 们旺盛的开花结实能力使得它们已经在美国和加拿大的野外大量繁殖、抑制了 本地植物的生长，成为了严重危害当地生物多样性的外来入侵性物种。另外， 还有一些园林植物开花时产生的花粉可以引起人们的过敏反应，造林树种的开 花结实会消耗营养、影响木材的生长。因此，对于花、果实和种子均没有经济 价值的经济植物，防止其开花结实具有重要意义。目前对控制植物不开花结实或者少开花结实的研究很少，而且主要集中在悬 铃木上。控制悬铃木开花结实的主要措施有1. 选育少果、无果品系通过对大量的实生悬铃木进行筛选，曾得到了果 球少的悬铃木无性系[1；利用秋水仙素化学诱变悬铃木，也曾得到了不开花的悬 铃木[2。2. 修剪控果通过修剪已经可以开花的枝条、促进当年不能开花的次级枝 条的生长来控制悬铃木的矮化结果，能有效控制悬铃木的结果量[3"。但是修剪 控果的工作量大，并且年年都要不断地重复操作，而且不能彻底解决问题。3.化学药剂处理利用对植物花果有催熟脱落作用的化学药剂(如乙烯利、 脱落酸、赤霉素、石硫合剂、碘化钾、三氯醋酸等)在开花期间喷洒或注射于悬 铃木上，促进花和幼果萎縮、脱落,从而达到控制悬铃木果毛污染的目的164、使用 化学药剂控制悬铃木开花结果的方法存在工作量大、除花除果不彻底、容易污 染环境等缺点。植物分子生物学和基因工程技术的发展为人们培育不育植物提供了一个快 速有效的途径。目前，人们可以利用基因工程技术可以培育雄性不育或者雌性 不育的植物，这些植物均表现自花授粉不能结实。如Mariani等人P'^将烟草的花 药绒毡层特异表达基因TA29启动子与RNase基因^mo^相融合，导入烟草和油菜 基因组中，培育出了雄性不育的转基因烟草和油菜；Colombo等用矮牵牛子 房的特异启动子FBP7控制bamase基因表达，培育出了雌性不育不结实的矮牵牛。 但是，雄性不育或者雌性不育基因工程技术培育出的植物仍然可以开花、形成 花粉，不能解决一些植物形成花絮和过敏花粉的问题；而且，雄性不育转基因 植物虽然自花授粉不结实，但异花授粉可以结实；雌性不育转基因植物虽然自 花授粉和异花授粉均不结实，但是它的花粉是可育的，可以传播给同种非转基 因植物。因此，已有的培育雄性不育和雌性不育植物基因工程技术不能彻底地 防止植物开花、结实的问题，建立一个新的、有效的防止植物开花结实的方法， 对于培育一些无花的植物品种具有重要意义。参见1. 曾幼佛,黄正华.悬铃木少毛栽培管理的调查研究.中国园林，1985， 1:21-232. 周业恒，江守和，鲁润龙，等.悬铃木无球果育种的研究.园艺学报，1993， 20:295-2983. 蒋淮军.采用抹头重剪法是解决悬铃木弊端的有效途径.江苏绿化，1997， 1: 304. 章利民.悬铃木修剪控果技术.江苏林业科技，2000， 27: 37-385. 王玉勤.二球悬铃木"除毛"修剪.园林.2006,5:426. 沈国华，汪企明,蒋慎明,等.应用化学药剂控制悬铃木飞毛污染的研究.江苏 林业科技，1995， 22: 1-57. 郭传友，王义彰，朱胜东，周守标.悬铃木落果的化学调控.淮北煤师院学 报.2002,23: 49-528. 彭香华，李项强.防止悬铃木果毛污染试验.新疆林业，2004， 3: 259. Mariani, C.， Gossele， V" Beuckeleer， M. D.， Truttner， J.， Leem肌s， J. andGoldberg, R. B. Induction of male sterility in plants by a chimaeric riboniiclease gene. Nature. 1990: 357: 384-38710. 沈革志，王新其，朱玉英，等.1厶294&111站6基因转化甘蓝产生雄性不育植 株.植物生理学报.2001， 27: 43-4811. 何业华，熊兴华，官春云，等.根癌农杆菌介导TA29-Bamase基因转化甘蓝 型油菜的研究.作物学报.2003， 29: 615-62012. 张慧军，王寰宇，石跃进，等..雄性不育基因对棉花的遗传转化.棉花学报. 2007， 19: 261-26613. Colombo, L.， Franken, J" Van der Krol AR>偷ich, P. E., Dons, H. J" Angenent， GC Downregulation of ovule-specific MADS box genes from petunia results in maternally controlled defects in seed development. Plant Cell. 1997， 9: 703-71
技术实现思路
本专利技术的目的是提出构建一种可以导致植物不开花的基因表达载体，该表 达载体转入植物细胞后，转基因植物的花原基细胞自动死亡，因而不能形成花 器官，从而达到植物彻底不开花、不结实的目的。本专利技术是这样实现的。无花植物的基因表达载体构建步骤为(1) 根据pCAMBIA1305.1质粒中农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子Tnos 序列，设计并合成2条引物，Nos-F:5'-ggggtecgatcgttcaaacatttggc-3，(下划线 部分为Kpn I酶切位点)；Nos-R: 5，-ggcttaagacactgatactttaattcccg咖3,(下划线部 分为EcoR I酶切位点)。以pCAMBIA1305.1质粒为摸板，利用PCR技术扩增 农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子Tnos片段。回收Tnos片段，经过Kpn I和 EcoR I酶切后，连接到pCAMPPNN质粒上，得到pCAMPPNN-Nos质粒。 pCAMPPNN质粒由pCAMBIA1305.1质粒改造而来，原pCAMBIA1305.1质粒 上由2x35S启动子控制的潮霉素基因表达盒被农杆菌胭脂碱合成酶基因启动子 控制的卡那霉素基因表达盒所替代；原控制报告基因gus的35S启动子被农杆 菌胭脂碱合成酶基因启动子所替代(附图说明图1)。(2) 根据barnase基因的序列，设计并合成2条引物，Bar-F: 5'-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种培育无花植物的基因表达载体，其特征在于构建步骤为： （１）根据ｐＣＡＭＢＩＡ１３０５．１质粒中农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子Ｔｎｏｓ序列，设计并合成２条引物：Ｎｏｓ－Ｆ：５’－ｇｇｇｇｔａｃｃｃｇａｔｃｇｔｔｃａａａｃａｔｔｔｇｇ ｃ－３’， Ｎｏｓ－Ｒ：５’－ｇｇｃｔｔａａｇａｃａｃｔｇａｔａｃｔｔｔａａｔｔｃｃｃｇ－３’； 以ｐＣＡＭＢＩＡ１３０５．１质粒为摸板，利用ＰＣＲ技术扩增农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子Ｔｎｏｓ片段，回收Ｔｎｏｓ片段，经过Ｋｐｎ Ⅰ和ＥｃｏＲ Ⅰ酶切后，连接到ｐＣＡＭＰＰＮＮ质粒上，得到ｐＣＡＭＰＰＮＮ－Ｎｏｓ质粒，ｐＣＡＭＰＰＮＮ质粒由ｐＣＡＭＢＩＡ１３０５．１质粒改造而来：原ｐＣＡＭＢＩＡ１３０５．１质粒上由２ｘ３５Ｓ启动子控制的潮霉素基因表达盒被农杆菌胭脂碱合成酶基因启动子控制的卡那霉素基因表达盒所替代；原控制报告基因ｇｕｓ的３５Ｓ启动子被农杆菌胭脂碱合成酶基因启动子所替代； （２）根据ｂａｒｎａｓｅ基因的序列，设计并合成２条引物： Ｂａｒ－Ｆ：５’－ｃｔｇｇｔａｃｃａｔｇｇｃａｃ ａｇｇｔｔａｔｃａａｃａｃｇ－３’， Ｂａｒ－Ｒ：５’－ｇｔｇｔｃｇａｃｃａｇａｃｃｔｔｔａｃａａａａａｔｃａｇａｔａａ－３’； 以解淀粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）基因组ＤＮＡ为摸板，通过Ｐ ＣＲ扩增淀粉芽孢杆菌核糖核酸水解酶基因ｂａｒｎａｓｅ，回收ｂａｒｎａｓｅ基因片段，经过ＫｐｎＩ和ＥｃｏＲ Ⅰ酶切后，连接到ｐＣＡＭＢＩＡ－Ｎｏｓ质粒（１）上，得到ｐＣＡＭＰＰＮＮ－Ｂａｒｎ－Ｎｏｓ质粒； （３）根据控制拟南芥花原基细胞 形成的ｌｅａｆｙ基因上游启动子序列，设计并合成２条特异引物：Ｌｆｙ－Ｆ：５’－ａｇｇｔｃｇａｃｇｔａｔａｔａａａｇａｔｃａａｃａｔｇａａｃａｇｇ－３’， Ｌｆｙ－Ｒ：５’－ｃａｇｔｃｇａｃａｔｃｔａｔｔｔｔｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃｔａ ｔｃ－３’； （４）以拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）的幼叶为材料，用ＣＴＡＢ法提取拟南芥基因组ＤＮＡ； （５）以拟南芥基因组ＤＮＡ为摸板，利用引物Ｌｆｙ－Ｆ和Ｌｆｙ－Ｒ通过ＰＣＲ技术扩增ｌｅａｆｙ基因的启动子 ； （６）将该片段克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上，并转化大肠杆菌。挑选单菌落测序； （７）将序列正确的启动子用Ｓａｌ Ⅰ切下，并连接...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈永勤，叶东，杨之帆，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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