一种大尺度DNA体内迭代组装的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种大尺度DNA体内迭代组装的方法。该方法将大尺度DNA的待组装片段分别转入预先进行过着丝粒修饰的交配型不同的两个宿主中，借助CRISPR/Cas9系统在着丝粒附近产生DSB诱导染色体删除和酵母同源重组，同时实现了待组装DNA片段的组装和被修饰染色体的整套删除，获得了含组装片段的单倍体宿主，之后可以立即与另一种交配型宿主(携带另一待组装片段)进行交配，开启下一轮组装。经多轮迭代组装，最终在体内实现大尺度DNA的迭代组装。实验表明，经过5轮迭代可实现由32Kb到1024Kb的组装，最重要的是组装过程仅需共培养两种交配型的酵母，无需任何繁琐低效的大尺度DNA提取分离纯化步骤，也无需复杂漫长的生孢与拆孢过程，操作简单、周期短。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物，尤其涉及一种大尺度dna体内迭代组装的方法。

技术介绍

1、大尺度dna的设计合成在微生物功能改造、生物功能的重塑以及人工生命体的构建方面至关重要。随着dna设计合成尺度的增加，对大尺度dna的合成能力提出了新的挑战。300kb以下的dna片段可以通过酶法体外组装获得，300kb以上的dna由于体外操作难度的增加和转化效率急剧降低，导致不再适合利用体外组装的方式完成。因此300kb级别以上的dna片段一般采用体内组装的方式进行。酿酒酵母由于具有强大的同源重组能力而成为理想的大尺度dna组装的宿主。目前大尺度dna体内组装主要采取一步组装和迭代组装两种方式。例如，基于原生质体转化的tar组装可以同时导入11个100kb左右的dna片段实现1.08mb片段的一步组装，但利用该方法进行大尺度dna组装策略普遍涉及复杂且低效的大片段的提取、富集与纯化操作，面临操作十分繁琐挑战，同时由于大尺度dna的转化效率低下，导致mb级别dna的往往面临合成操作繁琐且低效的问题。为了降低mb级别dna的操作难度提升组装效率，可以将大尺度dna拆分成若干小片段本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种大尺度DNA体内迭代组装的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述供体质粒包括顺序连接的：本轮切割位点S2、待组装DNA片段B、下一轮切割位点S3、LYS表达盒、sgRNA-S1表达盒、下一轮切割位点S3、公共同源臂HR、本轮切割位点S2；

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，

4.根据权利要3所述的方法，其特征在于，所述其余DNA片段按照逐一迭代组装的方式进行组装时，步骤2)具体包括：

5.根据权利要3所述的方法，其特征在于，所述其余DNA片段按照平行组装后再迭代的方式进行组...

【技术特征摘要】

1.一种大尺度dna体内迭代组装的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述供体质粒包括顺序连接的：本轮切割位点s2、待组装dna片段b、下一轮切割位点s3、lys表达盒、sgrna-s1表达盒、下一轮切割位点s3、公共同源臂hr、本轮切割位点s2；

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，

4.根据权利要3所述的方法，其特征在于，所述其余dna片段按照逐一迭代组装的方式进行组装时，步骤2)具体包括：

5.根据权利要3所述的方法，其特征在于，所述其余dna片段按照平行组装后再迭代的方式进行组装时，步骤2)具体包括：

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，所述融合片段xt-lable中的筛选标记基因选自ura3或fcy1；

8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，所述cas9切割位点s1～s4分别选自seq id no.4～8所示序列中的一种；

9.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴毅，苏舒心，元英进，马渊，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：