一种构建β地中海贫血CD17位点突变的HUDEP-2细胞株的引导编辑系统及方法技术方案

本发明专利技术公开了一种构建β地中海贫血CD17位点突变的HUDEP‑2细胞株的引导编辑系统及方法，属于基因编辑技术领域，所述引导编辑系统包括：nCas9 mRNA、工程化引导编辑gRNA和HUDEP‑2细胞株，所述引导编辑方法包括以下步骤：制备mRNA和gRNA，细胞准备，电转操作，细胞恢复和检测编辑效果。本发明专利技术的一种构建β地中海贫血CD17位点突变的HUDEP‑2细胞株的引导编辑系统及方法增加了pegRNA和nickRNA的稳定性，在提高编辑效率和降低脱靶率的同时，获得了高效安全的β地中海贫血CD17位点突变的HUDEP‑2细胞株。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因编辑，具体涉及一种构建β地中海贫血cd17位点突变的hudep-2细胞株的引导编辑系统及方法。

技术介绍

1、β地中海贫血是由于基因点突变或移码突变导致的β-珠蛋白肽链合成不足的一种遗传型血红蛋白病，全球已发现300多种突变类型，β-globin基因第一外显子cd17（a＞t）突变是我国β地中海贫血的热点突变，该点突变导致终止密码子提前出现，β链翻译提前终止，最终导致β珠蛋白链完全不能合成，属于β0突变，β地贫可通过基因编辑治疗获得治愈，但当前关于基因编辑的疗法是利用依赖dna双链断裂（dsb）的crispr/cas9技术实现的，除了脱靶率较高，dsb形成的副产物如indel和基因组dna大片段断裂和缺失，会造成遗传毒性，因此，急需一种不依赖dna双链断裂的crispr/cas9技术，能高效安全地获得β地中海贫血cd17位点突变的hudep-2细胞株的引导编辑系统及方法。

技术实现思路

1、本专利技术要解决的技术问题是提供一种能增加pegrna的稳定性，在提高编辑效率和降低脱靶率的同时，获得本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种构建β地中海贫血CD17位点突变的HUDEP-2细胞株的引导编辑系统，其特征在于，包括：nCas9 mRNA、工程化引导编辑gRNA和HUDEP-2细胞株，所述nCas9 mRNA为PEmax酶mRNA，所述PEmax酶mRNA的核苷酸序列如SEQ NO.1所示；所述工程化引导编辑gRNA包括：epegRNA和nickRNA，所述epegRNA的核苷酸序列如SEQ NO.2所示，所述nickRNA的核苷酸序列包括：nickRNA1核苷酸序列、nickRNA2核苷酸序列和nickRNA3核苷酸序列，所述nickRNA1核苷酸序列如SEQ NO.3所示，所述nickRNA2核苷酸序列...

【技术特征摘要】

1.一种构建β地中海贫血cd17位点突变的hudep-2细胞株的引导编辑系统，其特征在于，包括：ncas9 mrna、工程化引导编辑grna和hudep-2细胞株，所述ncas9 mrna为pemax酶mrna，所述pemax酶mrna的核苷酸序列如seq no.1所示；所述工程化引导编辑grna包括：epegrna和nickrna，所述epegrna的核苷酸序列如seq no.2所示，所述nickrna的核苷酸序列包括：nickrna1核苷酸序列、nickrna2核苷酸序列和nickrna3核苷酸序列，所述nickrna1核苷酸序列如seq no.3所示，所述nickrna2核苷酸序列如seq no.4所示，所述nickrna3核苷酸序列如seq no.5所示；所述hudep-2细胞株的核苷酸序列如seq no.6所示，所述hudep-2细胞株的pam核苷酸序列如序列seq no.7所示。

2.根据权利要求1所述的一种构建β地中海贫血cd17位点突变的hudep-2细胞株的引导编辑系统，其特征在于，所述epegrna的核苷酸序列包括：spacer核苷酸序列、scaffold核苷酸序列、逆转录模板rtt核苷酸序列、pbs核苷酸序列、linker核苷酸序列和tevopreq1核苷酸序列，所述spacer核苷酸序列如seq no.8所示，所述scaffold核苷酸序列如seq no.9所示，所述逆转录模板rtt核苷酸序列如seq no.10所示，所述pbs核苷酸序列如seq no.11所示，所述linker核苷酸序列如seq no.12所示，所述tevopreq1核苷酸序列如seq no.13所示。

3.根据权利要求2所述的一种构建β地中海贫血cd17位点突变的hudep-2细胞株的引导编辑系统，其特征在于，所述pbs核苷酸序列包含13...

【专利技术属性】
技术研发人员：镡颖，朱宝生，常乐，郭焱，孔亚敏，
申请(专利权)人：云南省第一人民医院，
类型：发明
国别省市：