【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及cfrna，尤其涉及一种基于cfrna的融合基因液态活检的探针引物组、体系与检测方法。
技术介绍
1、每年癌症死亡率是12.84％，其中每8个死亡的人中有1个因为恶性肿瘤死亡，全球新发癌症病例数约为1000万，中国占比约为23.7％，并且中国总体癌症死亡率为65.6％，是美国总体癌症死亡率的2倍多(美国约为27.6％)，这些数据表明，目前急需一款高性能，成本低，操作简单可应用于肿瘤早筛早诊及复发监测的检测产品。
2、当前肿瘤早筛早诊及复发监测的检测对象主要为体液样本中的循环肿瘤dna(ctdna)。然而现有技术显示在100％的特异性的前提下，聚合酶链式反应(pcr)单点检测限(lod)只能达到0.1％，第二代测序(ngs)定制化基因检测样本水平的lod只能达到0.02％，并且ngs存在价格高，检测周期长，操作复杂等劣势，不利于普惠性质的肿瘤筛查与监测项目。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题包括第二代测序(ngs)定制化基因检测样本水平的lod只能达到0.02％，并且ngs存在价格高，检测周期长，操作复杂等劣势，不利于普惠性质的肿瘤筛查与监测项目；常规反转录由于cfrna模板量受限，且随机引物在富集突变信号的同时也在放大野生型信号，这会导致在检测端难以达到个位拷贝数的融合检测性能。
2、因此，本专利技术提供了一种基于cfrna的融合基因液态活检的探针组、体系与检测方法，本专利技术聚焦于pcr的技术。通过测试，专利技
3、为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
4、本专利技术首先提供了一种基于cfrna的融合基因液态活检的探针引物组，所述探针为如seq id no：752所示的核苷酸序列，所述引物组为：
5、上游引物：如seq id no：750所示的核苷酸序列或如seq id no：753所示的核苷酸序列；
6、下游引物：如seq id no：751所示的核苷酸序列或如seq id no：754所示的核苷酸序列。
7、作为本专利技术的一种优选方案，上游引物：如seq id no：750所示的核苷酸序列；下游引物：如seq id no：751所示的核苷酸序列。
8、作为本专利技术的一种优选方案，所使用探针法检测中探针的荧光基团为fam，淬灭基团为mgb。
9、本专利技术还提供了一种基于cfrna的融合基因液态活检的反转录体系，所述反转录体系包括如seq id no：1-seq id no：749所示的核苷酸序列的引物。
10、作为本专利技术的一种优选方案，所述反转录体系中还包括dna酶i，dna酶i缓冲液，oligo dt，gp32，dntp与rt buffer。
11、本专利技术还提供了一种基于cfrna的融合基因液态活检的检测方法，rna先通过常规变性去除基因组dna后，采用人特异的mrna引物组结合强链置换活性反转录酶的体系进行反转录特异性的富集人mrna模版，最后通过arms-pcr即可实现超低拷贝分子的检测。
12、作为本专利技术的一种优选方案，所述检测方法包括以下步骤：
13、1)合成如seq id no：1-seq id no：751所示的引物、seq id no：753所示的引物与seq id no：754所示的引物以及如seq id no：752所示的探针；
14、2)提取体液样本中的cfrna；
15、3)将步骤2)提取到的cfrna进行变性；
16、4)在步骤3)的反应体系进行去基因组；
17、5)反转录：在步骤4)的反应体系中进行反转录；
18、6)检测：取步骤5)反转录完成的cdna，加入上游引物、下游引物与探针，通过arms-pcr进行超低拷贝分子的检测。
19、作为本专利技术的一种优选方案，步骤6)中，探针法上游引物的核苷酸序列如seq idno：750所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no：751所示；染料法上游引物的核苷酸序列如seq id no：753所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no：754所示。
20、作为本专利技术的一种优选方案，所使用的arms-pcr体系使用sybr染料或mgb探针检测。
21、在本专利技术中，本专利技术在反转录步骤，通过针对人mrna优化设计了一套非常规随机的反转录引物，同时在反转录时通过引入具有强链置换活性的反转录酶从而先放大cdna模板，在检测步骤，通过在引物端根据强错配的原则引入错配碱基，优化检测体系，使得引物特异性扩增融合模板，提高聚合酶的利用率。经过长期大量的试验研究，设计、筛选出一套检测人mrna的引物与检测分析的探针及检测体系。
22、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
23、1)本专利技术通过1管反应将微量的cfrna先放大8倍以上，再通过特异的引物与体系富集检测样本中的融合模板，使得整个检测体系全面满足肿瘤筛查与复发监测的检测需求，真正实现检测限达到个位拷贝数的融合检出性能。
24、2)本专利技术同时在保证检出性能的前提下，实验操作更方便，实验周期更短，检测成本更低。
25、3)本专利技术检测范围更全面；优化出一套检测cfrna中基因融合的反转录体系与检测体系，作为现有靶标cfdna的补充。
26、4)本专利技术检测性能好：在保证100％特异性的前提下，性能高于现有pcr与ngs技术，绝对拷贝数能达到3copies。
27、5)本专利技术价格更低可操作性更强：多个靶点在一管里检测，降低实验的成本，缩短实验步骤。
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1.一种基于cfRNA的融合基因液态活检的探针引物组，其特征在于，所述探针为如SEQIDNo：752所示的核苷酸序列，所述引物组为：
2.根据权利要求1所述的一种基于cfRNA的融合基因液态活检的探针引物组，其特征在于，上游引物：如SEQ ID No：750所示的核苷酸序列；下游引物：如SEQ ID No：751所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种基于cfRNA的融合基因液态活检的探针引物组，其特征在于，所使用探针法检测中探针的荧光基团为FAM，淬灭基团为MGB。
4.一种基于cfRNA的融合基因液态活检的反转录体系，其特征在于，所述反转录体系包括如SEQ ID No：1-SEQ ID No：749所示的核苷酸序列的引物。
5.根据权利要求4所述的基于cfRNA的融合基因液态活检的反转录体系，其特征在于，所述反转录体系中还包括DNA酶I，DNA酶I缓冲液，oligo dT，gp32，dNTP与RT buffer。
6.一种基于cfRNA的融合基因液态活检的检测方法，其特征在于，RNA先通过常规变性去除基因组D
7.根据权利要求6所述的一种基于cfRNA的融合基因液态活检的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
8.根据权利要求6所述的一种基于cfRNA的融合基因液态活检的检测方法，其特征在于，步骤6)中，探针法上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No：750所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No：751所示；染料法上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No：753所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No：754所示。
9.根据权利要求6所述的一种基于cfRNA的融合基因液态活检的检测方法，其特征在于，所使用的ARMS-PCR体系使用SYBR染料或MGB探针检测。
...【技术特征摘要】
1.一种基于cfrna的融合基因液态活检的探针引物组，其特征在于，所述探针为如seqidno：752所示的核苷酸序列，所述引物组为：
2.根据权利要求1所述的一种基于cfrna的融合基因液态活检的探针引物组，其特征在于，上游引物：如seq id no：750所示的核苷酸序列；下游引物：如seq id no：751所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种基于cfrna的融合基因液态活检的探针引物组，其特征在于，所使用探针法检测中探针的荧光基团为fam，淬灭基团为mgb。
4.一种基于cfrna的融合基因液态活检的反转录体系，其特征在于，所述反转录体系包括如seq id no：1-seq id no：749所示的核苷酸序列的引物。
5.根据权利要求4所述的基于cfrna的融合基因液态活检的反转录体系，其特征在于，所述反转录体系中还包括dna酶i，dna酶i缓冲液，oligo dt，gp32，dntp与rt buffer。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：洪强，董华，刘少东，刘利英，沈丹，洪汉华，陈海斌，
申请(专利权)人：杭州迪安医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：
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