【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及包含病毒样颗粒和微晶酪氨酸的组合物及其用于治疗癌症的用途。
技术介绍
1、近几十年来，癌症免疫疗法很大程度地改善了患者的生存率和生活质量，并已成为癌症治疗的支柱(esfahani k等人,curr oncol.2020年4月：27(s2)87–97)。
2、其中，癌症疫苗的开发旨在避免致癌感染，或旨在根据经典疫苗接种方法来破坏癌细胞，以训练免疫系统阻断侵袭的病原体。针对导致宫颈癌的人乳头瘤病毒(hpv)和导致肝癌的乙型肝炎病毒(hbv)的预防性癌症疫苗取得了巨大成功(stanley m.,philos transr soc lond b biol sci.2017；372(1732)；liu ma.,philos trans r soc lond b biolsci.2011；366(1579):2823-6)。
3、与预防癌症相比，开发针对已建立的癌症的疫苗更具挑战性，因为肿瘤通常具有免疫抑制作用，而且很难鉴定适当的靶点。此外，迄今为止使用的疫苗的免疫原性相当低(hollingsworth re,jansen k.,npj vaccines.2019；4:7)。先前开发治疗性癌症疫苗的尝试主要基于靶向肿瘤相关抗原(taa)，最近则基于靶向肿瘤特异性抗原(tsa)。靶向taa的效果一般，这可能与对自身抗原的免疫耐受有关。在t细胞发育过程中，针对自身抗原的高亲和性t细胞会被清除，而额外的外周耐受机制则负责将免疫反应保持在较低水平。与此相反，tsa要么是病毒衍生的，要么是突变的自身肽，不会或更不
4、由于病毒样颗粒(vlp)可组合诱导有效的细胞免疫和体液免疫反应，因此最近人们对使用病毒样颗粒接种癌症疫苗越来越感兴趣(mohsen mo等人,wires nanomednanobiotechnol.2019；e1579)。为了在接种vlp疫苗后进一步增加ctl反应，利用了淋巴系统的生理性质。将展示lcmv-gp33肽的黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus)样颗粒与微米大小的微晶佐剂(mct)配制在一起，结果表明不仅cumvtt-p33纳米颗粒修饰了微米大小的mct佐剂的表面并形成了局部储库，而且用这种组合接种疫苗增强了特异性ctl反应，在严格的b16f10p33小鼠肿瘤模型中介导了强烈的抗肿瘤作用(mohsen,heath等人,2019；heath mh等人,2020,frontiers in immunology 11:594911)。
5、原位(瘤内)免疫疗法最近也引起了人们对治疗实体癌的兴趣，其旨在产生局部和全身抗肿瘤作用(marabelle a等人,ann oncol.2017；28(suppl_12):xii33-xii43；nobuoka d等人,humvaccin immunother.2013；9(6):1234-6)。特别地，恶性黑色素瘤病变的可治疗性使人们对开发原位和局部疗法的兴趣与日俱增(middleton mr等人,br jcancer.2020；123(6):885-97)。最近的一些黑色素瘤的瘤内治疗的示例包括cmp-001(一种装载有a型cpgs的病毒样颗粒(vlp))与全身性抗pd-1组合(ribas a等人,cancerdiscov.2021,2998)。此外，lizotte等人表明，瘤内注射ecpmv可有效治疗真皮b16f10黑色素瘤，形成中心性肿瘤坏死(lizotte ph等人.nat nanotechnol.2016；11(3):295-303)。另一项研究将柔性植物vlp(pvx)与化疗药物多柔比星(doxorubicin，dox)组合包装在vlp中或混合在一起以治疗b16f10黑色素瘤。结果表明，瘤内注射pvx-vlp可延缓肿瘤进展，vlp与dox的共同给药增强了诱导的抗肿瘤反应并增加了存活率(lee kl等人,nano lett.2017；17(7):4019-28)。
6、鉴于改进针对癌症的免疫疗法仍面临巨大的挑战，因此需要可以广泛用于不同类型的肿瘤(特别是实体瘤)的有效、便宜、快速且安全的免疫疗法。
技术实现思路
1、我们惊奇地发现，用病毒样颗粒(vlp)配制并修饰的微晶酪氨酸(mct)可产生强力和有效的抗肿瘤反应，并抑制局部和远处肿瘤的生长。重要的是，本专利技术的免疫疗法不需要鉴定与患者个体相关的抗原。此外，本专利技术的组合物不包含与vlp相关或与vlp共价连接的肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。
2、特别地，本专利技术的优选组合物包含用病毒样颗粒(vlp)配制并修饰的微晶酪氨酸(mct)，发现该组合物可预防小鼠黑色素瘤，并在局部和全身抑制b16f10肿瘤的生长，如b16f10移植黑色素瘤小鼠模型所示。此外，当本专利技术的组合物在瘤内注射后，会在注射的肿瘤中形成免疫原性储库，增强多功能cd8+和cd4+t细胞，并支持通过再循环t细胞诱导的全身保护(免受未注射的远处肿瘤的侵袭)。此外，局部炎症和免疫反应与参与补体活化和胶原蛋白形成的基因上调有关。
3、因此，在第一方面，本专利技术提供了包含颗粒的组合物，其中，每个颗粒包含或优选由以下组成，
4、(a)至少一种病毒样颗粒(vlp)，优选重组vlp，以及
5、(b)至少一种微晶酪氨酸，优选微晶l-酪氨酸，
6、其中，微晶酪氨酸的中值粒径为0.1μm至50μm之间，优选1μm至10μm之间，中值粒径优选通过流式颗粒图像分析仪(fpia)确定，进一步优选按照实施例2所述确定；以及
7、其中，vlp不包含与vlp共价连接的肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原，进一步优选地，vlp不包含与vlp共价连接的抗原，例如过敏原；
8、优选地，组合物可以治疗肿瘤，优选恶性肿瘤，进一步优选地可以治疗实体瘤，优选恶性实体瘤，还进一步优选地，组合物可以瘤内治疗恶性实体瘤。
9、在另一方面，本专利技术提供了组合物，该组合物包含或优选由以下组成，
10、(a)至少一种病毒样颗粒(vlp)，优选重组vlp，以及
11、(b)至少一种微晶酪氨酸，优选微晶l-酪氨酸，
12、其中，微晶酪氨酸的中值粒径为0.1μm至50μm之间，优选1μm至10μm之间，中值粒径优选通过流式颗粒图像分析仪(fpia)确定，进一步优选按照实施例2所述确定；以及
13、其中，vlp不包含与vlp共价连接的肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原，进一步优选地，vlp不包含与vlp共价连接的抗原，例如过敏原；
14、优选地，组合物可以治疗肿瘤，优选恶性肿瘤，进一步优选地可以治疗实体瘤，优选恶性实体瘤，还进一步优选地，组合物可以瘤内治疗恶性实体瘤。
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1.组合物，所述组合物包含颗粒，其中，每个颗粒包含、优选由以下组成，
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述微晶酪氨酸的最大粒径为750μm，优选地，所述微晶酪氨酸的最大粒径为150μm。
3.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述VLP吸附在所述微晶酪氨酸上。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是水性组合物，优选地，所述微晶酪氨酸、优选所述微晶L-酪氨酸的浓度是0.5％至10％(酪氨酸重量/溶液体积)，优选地，所述微晶酪氨酸、优选所述微晶L-酪氨酸的浓度是1％至7.5％(酪氨酸重量/溶液体积)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述VLP是经修饰的VLP，所述经修饰的VLP包含至少一种经修饰的VLP多肽，优选由至少一种经修饰的VLP多肽组成，所述经修饰的VLP多肽包含：
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述VLP衍生自植物病毒或者是RNA噬菌体的VLP，优选地，所述植物病毒选自黄瓜花叶病毒(CuMV)、豇豆褪绿斑驳病毒(CCMV)和烟草花叶病毒(TM
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述VLP是经修饰的黄瓜花叶病毒(CuMV)的VLP，所述经修饰的CuMV的VLP包含至少一种经修饰的CuMV多肽，优选由至少一种经修饰的CuMV多肽组成，所述经修饰的CuMV多肽包含或优选由以下组成：
8.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述CuMV多肽是CuMV的外壳蛋白或者是与SEQID NO：1的序列同一性为至少90％、优选为95％的氨基酸序列。
9.根据权利要求7或8所述的组合物，其中，所述T辅助细胞表位取代所述CuMV多肽的N端区域，所述CuMV多肽的N端区域对应于SEQ ID NO：1的第2-12个氨基酸，优选地，所述T辅助细胞表位衍生自破伤风毒素或者是PADRE序列。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的组合物，其中，所述T辅助细胞表位包含SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的用于用途的组合物，其中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成。
12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述VLP、优选所述重组VLP包含包装在所述VLP中的免疫刺激物质，优选地，所述免疫刺激物质是toll样受体活化物质，进一步优选地，所述toll样受体活化物质是免疫刺激核酸，还进一步优选地，所述免疫刺激核酸是ssRNA。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，用于治疗患者的实体瘤的方法中的用途，其中，所述患者是人类患者或动物患者，优选地，所述动物患者选自马类动物，优选马、狗或猫，进一步优选地，所述动物患者是马。
14.根据权利要求13所述的用于所述用途的组合物，其中，所述治疗患者的实体癌的方法是瘤内治疗患者的所述实体癌的方法。
15.根据权利要求13或14所述的用于所述用途的组合物，其中，所述实体癌选自乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌和黑色素瘤癌症，优选黑色素瘤癌症。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.组合物，所述组合物包含颗粒，其中，每个颗粒包含、优选由以下组成，
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述微晶酪氨酸的最大粒径为750μm，优选地，所述微晶酪氨酸的最大粒径为150μm。
3.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述vlp吸附在所述微晶酪氨酸上。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是水性组合物，优选地，所述微晶酪氨酸、优选所述微晶l-酪氨酸的浓度是0.5％至10％(酪氨酸重量/溶液体积)，优选地，所述微晶酪氨酸、优选所述微晶l-酪氨酸的浓度是1％至7.5％(酪氨酸重量/溶液体积)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述vlp是经修饰的vlp，所述经修饰的vlp包含至少一种经修饰的vlp多肽，优选由至少一种经修饰的vlp多肽组成，所述经修饰的vlp多肽包含：
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述vlp衍生自植物病毒或者是rna噬菌体的vlp，优选地，所述植物病毒选自黄瓜花叶病毒(cumv)、豇豆褪绿斑驳病毒(ccmv)和烟草花叶病毒(tmv)，优选地，所述rna噬菌体的vlp是rna噬菌体qβ的vlp或rna噬菌体ap205的vlp。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述vlp是经修饰的黄瓜花叶病毒(cumv)的vlp，所述经修饰的cumv的vlp包含至少一种经修饰的cumv多肽，优选由至少一种经修饰的cumv多肽组成，所述经修饰的cumv多肽包含或优选由以下组成：
8.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述cumv多肽是cumv的外壳蛋白或者是与seqid no：1...
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