【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及由多能干细胞有效且大量地制造在医疗领域有用的自然杀伤细胞(以下，有时简称为“nk细胞”)的方法。
技术介绍
1、已经有数量众多的关于由多能干细胞诱导nk细胞的方法的报道。迄今为止的报道实例中，nk细胞的分化诱导工序以及其后的放大培养工序需要相当长的时间，并且使用培养皿等的平面培养(二维培养)是主流(参照例如非专利文献1和2)。专利文献1中记载了由多能干细胞球体经由造血祖细胞诱导nk细胞的方法。但是专利文献1中记载的多能干细胞球体的平均粒径小，而且对利用灌流培养的培养基更换没有任何记载。
2、现有技术文献
3、专利文献
4、专利文献1：wo2020/086889
5、非专利文献
6、非专利文献1：biochemical and biophysical research communicationsvolume 515,issue 1,12july 2019,pages 1-8
7、非专利文献2：methods mol biol.2019；2048:107-119.
技术实现思路
1、专利技术要解决的课题
2、依照迄今为止的报道实例诱导nk细胞时，分化诱导工序、放大培养工序需要相当长的时间，进而培养培养基的更换操作难以实现机械化，因此存在人为操作导致最终制品的品质受到影响的风险。另外，还预期培养基更换导致工时增加，从而造成制造成本也增加。特别是二维培养的情形中，培养规模的规模扩大在理论上是
3、用于解决课题的手段
4、本专利技术人等进行了反复研究，结果发现，通过使在三维培养中形成的多能干细胞的球体的平均粒径为200μm以上并在该状态下组合灌流培养法，可以效率良好且迅速地诱导nk细胞。另外还得知本方法制造的nk细胞具有高活性，冷冻解冻后也维持其活性，因此可以用作细胞药品的有效成分。
5、本专利技术人等基于该见解进一步反复研究，结果完成了本专利技术。
6、即，本专利技术如下所述。
7、[项目1]
8、自然杀伤(nk)细胞的制造方法，其特征在于，该制造方法包括：
9、(1)在第一培养基中形成平均粒径200μm以上的多能干细胞球体的工序；
10、(2)通过使用第二培养基的三维培养，将工序(1)中形成的多能干细胞球体诱导为包含造血祖细胞的细胞群的工序；和
11、(3)通过使用第三培养基的三维培养，将工序(2)中所得的包含造血祖细胞的细胞群诱导为包含nk细胞的细胞群的工序；
12、且通过灌流培养法进行工序(1)至(3)。
13、[项目2]
14、根据项目1所述的方法，其特征在于，在不使用三维培养用载体和细胞外基质的情形下实施工序(1)至(3)。
15、[项目3]
16、根据项目2所述的方法，其中，工序(1)中的灌流培养使用细孔直径15～75μm的分离膜进行。
17、[项目4]
18、根据项目2所述的方法，其中，工序(2)中的灌流培养使用细孔直径45～225μm的分离膜进行。
19、[项目5]
20、根据项目2所述的方法，其中，工序(3)中的灌流培养使用细孔直径0.2～10μm的分离膜进行。
21、[项目6]
22、根据项目1～5中任一项所述的方法，其特征在于，通过连续的灌流培养法进行工序(1)至(3)。
23、[项目7]
24、根据项目1～6中任一项所述的方法，其中，第一培养基包含rock抑制剂。
25、[项目8]
26、根据项目1～7中任一项所述的方法，其中，第二培养基包含vegf、bmp4和gsk3β抑制剂。
27、[项目9]
28、根据项目8所述的方法，其中，第二培养基进一步包含rock抑制剂或bfgf。
29、[项目10]
30、根据项目1～7中任一项所述的方法，其中，第二培养基包含scf、tgfβ/smad抑制剂和vegf。
31、[项目11]
32、根据项目10所述的方法，其中，第二培养基进一步包含rock抑制剂或bfgf。
33、[项目12]
34、根据项目1～7中任一项所述的方法，其中，第二培养基包含scf和flt3l。
35、[项目13]
36、根据项目12所述的方法，其中，第二培养基进一步包含选自rock抑制剂、il-3和il-7中的至少一者。
37、[项目14]
38、根据项目1～7中任一项所述的方法，其中，工序(2)中的三维培养包括：
39、(2－1)使用包含vegf、bmp4和gsk3β抑制剂的培养基作为第二培养基的培养工序；
40、(2－2)使用包含scf、tgfβ/smad抑制剂和vegf的培养基作为第二培养基的培养工序；和
41、(2－3)使用包含scf和flt3l的培养基作为第二培养基的培养工序。
42、[项目15]
43、根据项目1～14中任一项所述的方法，其中，第三培养基包含il-15和scf。
44、[项目16]
45、根据项目15所述的方法，其中，第三培养基进一步包含il-7和flt3l。
46、[项目17]
47、根据项目1～16中任一项所述的方法，其不需要nk细胞的分选工序。
48、专利技术效果
49、本专利技术的特征在于，通过利用三维灌流培养的制造方法而有效地一次性制造大量的nk细胞。通过本专利技术的方法制造的nk细胞对各种癌细胞显示高的细胞抑制活性，即使冷冻，该活性也不会降低而可以维持，因此可以大规模适用于临床。
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1.自然杀伤(NK)细胞的制造方法，其特征在于，该制造方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在不使用三维培养用载体和细胞外基质的情形下实施工序(1)至(3)。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，工序(1)中的灌流培养使用细孔直径15～75μm的分离膜进行。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，工序(2)中的灌流培养使用细孔直径45～225μm的分离膜进行。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，工序(3)中的灌流培养使用细孔直径0.2～10μm的分离膜进行。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，通过连续的灌流培养法进行工序(1)至(3)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，第一培养基包含ROCK抑制剂。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，第二培养基包含VEGF、BMP4和GSK3β抑制剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，第二培养基进一步包含ROCK抑制剂或bFGF。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，第二培养基包含SCF、TG
11.根据权利要求10所述的方法，其中，第二培养基进一步包含ROCK抑制剂或bFGF。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，第二培养基包含SCF和Flt3L。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，第二培养基进一步包含选自ROCK抑制剂、IL-3和IL-7中的至少一者。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，工序(2)中的三维培养包括：
15.根据权利要求1所述的方法，其中，第三培养基包含IL-15和SCF。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，第三培养基进一步包含IL-7和Flt3L。
17.根据权利要求1所述的方法，其不需要NK细胞的分选工序。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.自然杀伤(nk)细胞的制造方法，其特征在于，该制造方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在不使用三维培养用载体和细胞外基质的情形下实施工序(1)至(3)。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，工序(1)中的灌流培养使用细孔直径15～75μm的分离膜进行。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，工序(2)中的灌流培养使用细孔直径45～225μm的分离膜进行。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，工序(3)中的灌流培养使用细孔直径0.2～10μm的分离膜进行。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，通过连续的灌流培养法进行工序(1)至(3)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，第一培养基包含rock抑制剂。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，第二培养基包含vegf、bmp4和gsk3β抑制剂。
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【专利技术属性】
技术研发人员：仓知建始，山田雅司，木村博信，田村康一，
申请(专利权)人：希里欧斯株式会社，
类型：发明
国别省市：
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