本发明专利技术公开了猪内源性反转录病毒载体及其构建方法与应用。本发明专利技术构建的载体具有以下优点：１）能高效感染多种细胞，具有广泛的宿主范围；２）能高效地将目的基因整合进所侵染的细胞基因组中，并高水平表达；３）具有高效侵染的特性，能将重组目的基因传递给整个细胞群体，更适合于基因治疗等用途；４）与组织特异性启动子结合，则可能达到目的基因在特定组织或器官中定位表达的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及反转录病毒载体及其构建方法，特别是涉及猪内 源性反转录病毒载体及其构建方法。
技术介绍
反转录病毒载体是临床基因治疗试验中较常使用的基因转移载体，与其它非病毒 载体和病毒载体相比具有许多独特的优点，包括可高效转导多种类型的细胞、能够整合进 宿主细胞染色体中并长期稳定表达其携带的外源基因。目前人们使用的反转录病毒载体中 都移除了结构蛋白编码序列gag、poKerw基因的大部分，使病毒丧失复制形成病毒粒子的 能力。载体包装系统中需包括这三种病毒结构蛋白，方法是构建表达这三种蛋白的共转 染质粒，或将这三种基因预先整合到包装细胞系中。病毒结构还应包括必须的包装病毒RNA 的序列(包装信号Ψ+)、编码病毒RNA的反转录以及前病毒整合的序列(长末端重复序列 LTR, RNA引物结合位点PBS以及聚嘌呤区域PP)。绝大多数反转录病毒载体都是基于莫罗尼小鼠白血病病毒(Mo-MLV)构建的，含 有延伸包装信号(extended Ψ+)，普遍认为它能提高定位于gag基因开放读码框(ORF)上 的RNA分子在核质传输中的效率，并且能增加病毒滴度。延伸包装信号(extended Ψ+)即 包装信号(Ψ+)延伸至gag基因编码区的5’端，gag基因起始密码子ATG需突变为终止密 码子TAG，以防止野病毒(RCR)的产生。小鼠干细胞病毒(MSCV)载体来源于小鼠胚胎干细胞病毒(MESV)以及LN系列反 转录病毒载体(L代表逆转录病毒的LTR，具有启动子功能，N代表了 neo基因)。MSCVne0载 体转染到包装细胞系后瞬时表达或者整合后稳定表达，载体包含延伸的包装信号Ψ+，新霉 素抗性基因，以及目的基因。该载体通过一段经特殊设计的5’长末端重复序列(LTR)在造 血和胚胎细胞中稳定高表达。LTR使目的基因在干细胞或者其他哺乳动物细胞系中高水平 持续表达。目的基因被插入到LTR下游调控序列-多克隆位点(MSC)中。鼠磷酸甘油酸脂 激酶(PKG)启动子调控其下游序列在真核细胞中用于抗性筛选的新霉素抗性基因(NecZ)。 MSCVneo载体还包含有大肠杆菌质粒骨架，包括大肠杆菌(E. coli ori.)和氨苄青霉素抗 性β内酰胺酶基因(Amp1O。反转录病毒的整合可以发生在基因组的任何位置，存在着激活原癌基因的潜在危 险性。猪内源性反转录病毒(PERV)是在长期的进化过程中整合进猪基因组中的前病毒序 列，迄今为止，未有文献报道PERV在猪体内的整合能引发猪体的病变或变异(如原癌基因 的激活等)，由此看来，与其它常用的反转录病毒相比，用PERV构建载体可能具有更好的安 全性。目前，已经发现多群PERV，包括Y群的1 5亚群、β群的1 4亚群 等。Akiyoshi(Akiyoshi DE, et al. Identification of a full-length cDNA for an endogenousretrovirus of miniature swine. J Virol, 1998, 72 (5) :4503_4507·)等克隆的小型猪PERV-MSL的序列长度为8132bp。与其它反转录病毒相似，PERV的基因组结构包 括 5，区、gag、pol、env、3，区等 5 部分。1997年，PERV在体外对人源细胞具有感染性的发现，引起了人们对猪-人异种移 植病原安全性的广泛性关注，也使得PERV的研究成为了一个热点问题。经过了几年的努 力，有关PERV的生物学及分子生物学特性已比较清楚，对其遗传背景及特性也比较清晰。 PERV感染的人源细胞从其生长特性及折光性上均未发现变化，且感染的细胞也无细胞病 变的发生，对其病原性的评估还未有一致的结论。应该指出的是，人与猪有着几千年的亲 密接触史，至今未见PERV感染人的报道，Heneine等(Heneine W, et al. No evidence of infection with porcine endogenous retrovirus inrecipients of porcine islet-cell xenografts. Lancet. 1998,352(9129) 695-9.)曾对接受过猪胰岛移植的160例糖尿病病 人进行了多年的跟踪检测，未发现有PERV感染的证据，这暗示着PERV对人致病的可能性很 小。由于PERV是以前病毒的形式存在于猪细胞基因组中的，根据基因同源重组的原 理，在PERV清晰的分子生物学背景的基础上，用其构建新型的反转录病毒载体，对于转基 因猪及PERV生物学特性的研究具有重要的意义。目前，国际上对PERV的研究均着眼于异种移植中其病原安全性的评价等方面，至 今尚未见有利用其作为反转录病毒载体的报道。
技术实现思路
本专利技术提供了在猪源细胞中特异表达或可在其它哺乳动物细胞表达的质粒型反 转录病毒载体PM-I。本专利技术所提供的猪内源性反转录病毒载体PM-I由下列DNA元件组成DPERV 的 5，LTR 启动子；2) MSCVneo 的延伸包装信号(extended Ψ+);3)小鼠磷酸甘油酸脂激酶(PGK)启动子及位于PGK启动子下游并受其调控的新霉 素抗性基因(neor)；4) PERV的聚嘌呤区域PP及其3，LTR启动子；5)大肠杆菌质粒骨架，包括大肠杆菌(E. coli ori.)和氨苄青霉素抗性β内酰胺 酶基因(Ampr)。具体来讲，所述反转录病毒载体PM-I的核苷酸序列如序列表中序列11所示。本专利技术还提供了上述猪内源性反转录病毒载体PM-I的构建方法。本专利技术所提供的构建方法，包括以下步骤1)按照猪PERV全基因序列与MSCVne0序列设计5对引物，扩增P_5，LTR片段的引 物对具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列，扩增Ψ片段的引物对具有序列表中序列 3和序列4的核苷酸序列，扩增P_3’LTR片段的引物对具有序列表中序列5和序列6的核苷 酸序列，扩增neo片段的引物对具有序列表中序列7和序列128的核苷酸序列，扩增O-Amp 片段的引物对具有序列表中序列9和序列10的核苷酸序列，然后PCR扩增得到P-5’ LTR、 Ψ、P-3，LTR、neo 和 O-Amp 片段；2)通过重叠PCR技术及酶切连接的方法构建出猪内源性反转录病毒载体PM-1。4在上述载体的构建方法中，所述步骤1)的PCR反应体系包括0. 5 μ 1 cDNA(100ng/y 1)，弓I物R禾口 F各1μ 1(20μΜ)，4μ 1 dNTP (2. 5mM), 0. 5 μ 1 Super-Ltaq DNA 聚合酶，5 μ 1 10XPCR Buffer，38 μ 1灭菌水。PCR反应条件为先94°C变性3min ；然后 940C 30s, 560C 45s, 72°C lmin30s，30 个循环；最后 72°C 7min。步骤2)的重叠 PCR 的反应体系包括0. 5 μ 1 cDNA 1 (lOOng/ μ 1) +0. 5 μ 1 cDNA2 (lOOng/ μ 1)，弓 | 物 R 禾口 F 各 1 μ 1 (20 μ Μ)，4 μ 1 dNTP (2. 5mM)，0· 5 μ 1 Super-Ltaq DNA聚合酶，5本文档来自技高网...
【技术保护点】
猪内源性反转录病毒载体ＰＭ－１，由下列ＤＮＡ元件组成： １）ＰＥＲＶ的５’ＬＴＲ启动子； ２）ＭＳＣＶｎｅｏ的延伸包装信号； ３）小鼠磷酸甘油酸脂激酶启动子及位于ＰＧＫ启动子下游并受其调控的新霉素抗性基因； ４）ＰＥＲＶ的聚嘌呤区域ＰＰ及其３’ＬＴＲ启动子； ５）大肠杆菌质粒骨架，包括大肠杆菌和氨苄青霉素抗性β内酰胺酶基因。
【技术特征摘要】
猪内源性反转录病毒载体PM 1，由下列DNA元件组成1)PERV的5’LTR启动子；2)MSCVneo的延伸包装信号；3)小鼠磷酸甘油酸脂激酶启动子及位于PGK启动子下游并受其调控的新霉素抗性基因；4)PERV的聚嘌呤区域PP及其3’LTR启动子；5)大肠杆菌质粒骨架，包括大肠杆菌和氨苄青霉素抗性β内酰胺酶基因。2.根据权利要求1所述的猪内源性反转录病毒载体ΡΜ-1，其特征在于所述反转录病 毒载体PM-I的核苷酸序列如序列表中序列11所示。3.权利要求1所述猪内源性反转录病毒载体PM-I的构建方法，包括以下步骤1)按照猪PERV全基因序列与MSCVne0序列设计5对引物，扩增P_5’LTR片段的引物 对具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列，扩增Ψ片段的引物对具有序列表中序列3 和序列4的核苷酸序列，扩增P-3’ LTR片段的引物对具有序列表中序列5和序列6的核苷 酸序列，扩增neo片段的引物对具有序列表中序列7和序列8的核苷酸序列，扩增O-Amp片 段的引物对具有序列表中序列9和序列10的核苷酸序列，然后PCR扩增得到P-5’LTR、Ψ、 P-3，LTR、neo 和 O-Amp 片段；2)通过重叠PCR技术及酶切连接的方法构建出猪内源性反转录病毒载体PM-1。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于所述步骤1)的PCR反应体系包括 0. 5μ 1 cDNAdOOng/μ 1)，弓 ι物 R 禾口 F 各 1μ 1(20μΜ...
【专利技术属性】
技术研发人员：章金刚，吕茂民，吴健敏，冯书堂，徐述，丁芳，马玉媛，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所，广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：11
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