本发明专利技术公开了一种猪内源性反转录病毒整合拷贝数的荧光定量ＰＣＲ检测方法及其应用。该方法是采用基于ＳＹＢＲ?Ｇｒｅｅｎ?Ｉ染料的荧光定量ＰＣＲ技术对整合在基因组中的猪内源性反转录病毒拷贝数进行检测，检测对象是ＰＥＲＶ?ｐｏｌ基因保守区。该检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好，并具有快速、简便、费用低廉的优点，能够快速准确的检测出ＰＥＲＶ的拷贝数，并估算出单细胞基因组中整合的ＰＥＲＶ拷贝数，既可用于异种移植的小型猪供体及猪源生物材料基因组中整合的ＰＥＲＶ拷贝数的快速筛选，也可用于异种移植后ＰＥＲＶ传播的长期监测与远期评估，具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于核酸检测
，特别是涉及一种猪内源性反转录病毒整合拷贝数 的荧光定量PCR检测方法及其应用。
技术介绍
随着移植医学和免疫学研究的进展，也由于人源供体器官的短缺，猪被选定为最 合适的异种移植供体。培育SPF猪可以消除许多病原体，但内源性病毒无法去除。1997年 Pateince 等(“Infection of human cells by an endogenous retrovirus ofpigs. Nat Med, 1997,3(3) =282-286.)首次发现猪内源性反转录病毒(porcineendogenous retrovirus,PERV)在体外可以感染多种人源细胞，这一发现引起了人们对异种移植安全性 的广泛关注。PERV是指以前病毒DNA形式整合进猪细胞基因组中，并随细胞染色体复制而 复制的反转录病毒，在形态学和生化学上具有哺乳动物C型病毒的典型特征。虽然目前尚 无证据表明PERV可在体内感染人源细胞，且也无证据表明PERV在猪体内和接受异种组织/ 器官移植的人体内可产生任何病理作用，但人们仍担心由于接受异种移植的人体处于高度 免疫抑制状态，PERV会跨越种间屏障，并且发生突变或与其它人类病毒重组而获得毒力及 传染性。由于PERV是在长期的进化过程中整合进猪的基因组中的，所以不同品系间存在 着不同的拷贝数，同一品系的不同个体中也存在不同的拷贝数，且其中仅有少量为具有传 染性的完整的前病毒，因此有必要通过筛选得到并选育PERV低拷贝猪，从而有助于进一步 获得不含可复制的嗜人性PERV的猪作为异种移植的优良供体。与其它反转录病毒相似，PERV的基因组结构包括5'区、gag、p0l、enV、3'区等5 部分。Pol为多聚酶基因，在各个品系猪种的PERV中均较为保守。Argaw等(“Development of a real time quantitative PCR assay for detection of porcineendogenous retrovirus. ” J Virol Med. 2002,106(1) :97_106.)建立了基于 Taqman 探针的实时定量 PCR与RT-PCR方法，用于检测组织或细胞中的PERV DNA或RNA。Taqman探针特异性好，但 除需要合成序列特异性引物外，还需合成荧光探针，成本较高；SYBRGreen I法经济，只需合 成序列特异性引物，然而反应特异性相对较差。但通过熔解曲线和凝胶电泳证实特异性，确 认没有产生引物二聚体及非特异性扩增，SYBR GreenI荧光定量PCR也可以成为一种高特 异性的方法。建立猪内源性反转录病毒整合拷贝数的荧光定量PCR检测方法，既可用于异种移植的小型猪供体及猪源生物材料基因组中整合的PERV拷贝数的快速筛选，也可用于异种 移植后PERV传播的长期监测与远期评估，具有较强的应用价值。
技术实现思路
本专利技术提供了一种猪内源性反转录病毒整合拷贝数的荧光定量PCR检测方法。本专利技术所提供的检测方法，是采用基于SYBR Green I染料的荧光定量PCR技术对整 合在基因组中的猪内源性反转录病毒拷贝数进行检测，检测对象是PERV pol基因保守区。所述检测体系中使用的上游引物和下游引物分别具有序列表中序列1和序列2的 核苷酸序列。所述上、下游引物浓度为50nmol/L。 所述PCR反应的退火温度是60°C。所述检测体系中的被检样品包括来源于猪的血液与组织样品、异种移植受者的血 液与组织样品、猪源生物材料。具体来讲，所述猪内源性反转录病毒整合拷贝数的荧光定量PCR检测方法包括以 下步骤1)分离外周血单个核细胞，细胞计数后提取基因组DNA ；2)采用SYBR Green I嵌合荧光法进行荧光定量PCR，其PCR反应体系为 RealMasterMix (SYBR Green Ι)9μ L, DNA 样本 1 μ L，上、下游引物各 lpmol，加无菌去离子 水补充反应体系至20 μ L ；3)进行PCR扩增，PCR扩增程序为先94°C变性5min ；然后94°C 30s, 60°C 30s， 68°C 30s，共循环42次；最后72°C延伸5min。PCR完成后，按0. 2°C s—1的升温速率从60°C 升至90°C进行熔解曲线的分析验证；4)扩增出特异性PCR产物后，构建标准品质粒，并按10倍梯度稀释将其稀释成 IO8-IO4拷贝/ μ L 5个浓度梯度，按上述荧光定量PCR反应体系与反应程序在荧光定量PCR 仪上进行扩增，反应结束后，根据得到的各个浓度梯度的循环阈值(Ct)采用计算机软件自 动绘制荧光定量PCR标准曲线；5)取步骤1)中制备的基因组DNA为模板，按上述荧光定量PCR反应体系与反应程 序在荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照(不加模板，NTC)和阳性对照(如 ΡΚ15细胞基因组DNA为模板)的扩增。反应结束后，将DNA样本的循环阈值(Ct)与标准曲 线对照，可计算出DNA样本中PERV的拷贝数，再根据该DNA样本所来源的细胞数，即可估算 出单细胞基因组中整合的PERV拷贝数。本专利技术的第二个目的是提供一种猪内源性反转录病毒整合拷贝数的荧光定量PCR 检测试剂盒。本专利技术所提供的试剂盒包括RealMasterMix (SYBR Green I) 9 μ L，上、下游引物各 Ipmol。本专利技术涉及一种猪内源性反转录病毒整合拷贝数的荧光定量PCR检测方法。该检 测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好，并具有快速、简便、费用低廉的优点，能够快速 准确的检测出PERV的拷贝数，并估算出单细胞基因组中整合的PERV拷贝数，既可用于异种 移植的小型猪供体及猪源生物材料基因组中整合的PERV拷贝数的快速筛选，也可用于异 种移植后PERV传播的长期监测与远期评估，具有较大的实际意义和广阔的应用前景。下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。附图说明图1为PCR扩增pol基因保守区的琼脂糖凝胶电泳检测结果图2为标准品质粒为模板进行荧光定量PCR的扩增曲线图3为标准品质粒为模板进行荧光定量PCR的熔解曲线图4为标准品质粒为模板进行荧光定量PCR的标准曲线 图5为样品为模板进行荧光定量PCR的扩增曲线图6为样品为模板进行荧光定量PCR的熔解曲线具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、猪内源性反转录病毒整合拷贝数的荧光定量PCR检测1、PBMC基因组DNA的获取取来源于小型猪的EDTA-K2抗凝血(例如实验中可以从前腔静脉采集)，采用 FicolI-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)。方法为取抗凝血2mL，与 RPMI1640培养液(购自美国Sciencell公司)1 1混勻后，小心加于4mL的人淋巴细胞分 离液的液面上，以2000r/min离心15min，用毛细吸管收集界面上的细胞，放入含RPMI1640 培养液5mL的离心管中，充分混勻后，以1500r/min离心lOmin。小心弃去上清液，加入4mL RPMI1640培养液吹打混勻，1500r/min离心lOmin，再重复洗一次即得PBMC，并进行细胞计 数。PBMC还可以通过其本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪内源性反转录病毒整合拷贝数的荧光定量ＰＣＲ检测方法，是采用基于ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ染料的荧光定量ＰＣＲ技术对整合在基因组中的猪内源性反转录病毒拷贝数进行检测，检测对象是ＰＥＲＶ ｐｏｌ基因保守区。
【技术特征摘要】
一种猪内源性反转录病毒整合拷贝数的荧光定量PCR检测方法，是采用基于SYBR Green I染料的荧光定量PCR技术对整合在基因组中的猪内源性反转录病毒拷贝数进行检测，检测对象是PERV pol基因保守区。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述检测体系中使用的上游引物和 下游引物分别具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述上、下游引物浓度为50nmol/L。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述PCR反应的退火温度是60°C。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述检测体系中的被检样品包括来 源于猪的血液与组织样品、异种移植受者的血液与组织样品、猪源生物材料。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述猪内源性反转录病毒整合拷贝 数的荧光定量PCR检测方法包括以下步骤1)分离外周血单个核细胞，细胞计数后提取基因组DNA;2)采用SYBRGreen I嵌合荧光法进行荧光定量PCR，其PCR反应体系为 RealMasterMix 9 μ L，DNA样本1 μ L，上、下游引物各Ipmol，加无菌去离子水补充反应体系 至 20 μ L ；3)进行PCR扩增，PCR扩增程序为...
【专利技术属性】
技术研发人员：章金刚，马玉媛，吴健敏，冯书堂，吕茂民，杨勇贤，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所，广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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