【技术实现步骤摘要】
本公开涉及生物化学、分子生物学和经由电泳分析蛋白质的领域。序列表的通过引用并入本文中以电子方式提交的文本文件的内容通过引用以其整体并入本文中：序列表的计算机可读格式副本(文件名：rege-019-001wo_seqlist_st25.txt，记录日期：2020年12月22日，文件大小1千字节)。
技术介绍
1、基于毛细管的电泳(ce)和基于微芯片的毛细管电泳(mce)是制药行业常用的分析方法，其用于基于蛋白质大小表征治疗性蛋白质的完整性和纯度，并提供质量控制。虽然标准的、行业推荐的样品制备方法对许多蛋白质都很有效，但由于通过ce和mce的差的分离和定量，高度糖基化的蛋白质是有问题的。此外，mce图谱中的部分糖基化的峰和非糖基化的峰可能与杂质峰重叠，并且干扰定量。因此，本领域需要可以克服使用糖基化的蛋白质工作的挑战的另外的样品制备方法。本专利技术提供了用于标记高度糖基化的蛋白质的方法，所述方法可以用于制备通过电泳方法如ce和mce进行分析的蛋白质。
技术实现思路
1、本公开提供了分析包含感兴...
【技术保护点】
1.一种分析包含感兴趣的蛋白质的样品的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含Fc结构域，所述方法包含：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Fc结构域是人IgG1 Fc结构域，人IgG2 Fc结构域，人IgG3 Fc结构域，或人IgG4 Fc结构域。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含至少一个糖基化位点。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含1至8个N连接的糖基化位点。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是包含至少一个附接的聚糖的糖基化蛋白质。
6.根据...
【技术特征摘要】
1.一种分析包含感兴趣的蛋白质的样品的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含fc结构域，所述方法包含：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述fc结构域是人igg1 fc结构域，人igg2 fc结构域，人igg3 fc结构域，或人igg4 fc结构域。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含至少一个糖基化位点。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含1至8个n连接的糖基化位点。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是包含至少一个附接的聚糖的糖基化蛋白质。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含抗原结合结构域。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含受体-fc融合蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述受体-fc-融合蛋白是陷阱蛋白或微型陷阱蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述陷阱蛋白是il-1陷阱蛋白，vegf陷阱蛋白或tnf陷阱蛋白。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述陷阱蛋白选自利纳西普、阿柏西普和依那西普。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质选自阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿达木单抗-阿托(adalimumab-atto)、阿多-曲妥珠单抗(ado-trastuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利西尤单抗(alirocumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝那利珠单抗(benralizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝佐洛单抗(bezlotoxumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗维汀(brentuximab vedotin)、布罗达单抗(brodalumab)、卡纳单抗(canakinumab)、卡罗单抗喷地肽(capromabpendetide)、塞妥珠单抗聚乙二醇(certolizumab pegol)、西米普利单抗(cemiplimab)、西妥昔单抗(cetuximab)、地诺单抗(denosumab)、迪妥昔单抗(dinutuximab)、度普利尤单抗(dupilumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃洛妥珠单抗(elotuzumab)、艾米希组单抗(emicizumab-kxwh)、美坦新阿利西尤单抗(emtansinealirocumab)、依维那珠单抗(evinacumab)、依洛尤单抗(evolocumab)、法西单抗(fasinumab)、戈利木单抗(golimumab)、古塞库单抗(guselkumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、依达赛珠单抗(idarucizumabn)、英夫利昔单抗(infliximab)、英夫利昔单抗-阿伯达(infliximab-abda)、英夫利昔单抗-dyyb(infliximab-dyyb)、伊匹单抗(ipilimumab)、依奇珠单抗(ixekizumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、奈斯伐单抗(nesvacumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥必托昔单抗(obiltoxaximab)、阿托珠单抗(obinutuzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、瑞西巴库单抗(raxibacumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、雷珠单抗(rinucumab)、利妥昔单抗(rituximab)、沙利鲁单抗(sarilumab)、苏金单抗(secukinumab)、塞妥昔单抗(siltuximab)、托珠单抗(tocilizumab)、托珠单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲弗单抗(trevogrumab)、优特克单抗(ustekinumab)、和维多珠单抗(vedolizumab)。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是选自下列的双特异性抗体：抗-cd3 x抗-cd20双特异性抗体，抗-cd3 x抗-mucin 16双特异性抗体，和抗cd3 x抗前列腺特异性膜抗原双特异性抗体。
13.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一个附接的聚糖是n连接或o连接的。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含游离胺，并且其中所述荧光标记物包含共价连接至感兴趣的蛋白质中的游离胺的胺反应性基团。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述内切糖苷酶催化n-连接的聚糖的去糖基化。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述内切糖苷酶选自肽-n-糖苷酶f(pngase f)、内切糖苷酶h(endo h)、内切糖苷酶s(endo s)、内切糖苷酶d、内切糖苷酶f1、内切糖苷酶f2和内切糖苷酶f4。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述pngase f是快速pngase f。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述快速pngase f是非还原性的。
19.根据权利要求17所述的方法，其中对所述样品进行去糖基化包含将所述样品加热到约50℃持续10分钟。
20.根据权利要求1所述的方法，其中对所述样品进行去糖基化包含反应混合物，所述反应混合物在10μl反应体积(不包含快速pngase f的体积)中包含0.2-1.5mg的标记的感兴趣的蛋白质和1-5μl的快速pngase f。
21.根据权利要求13所述的方法，其中所述内切糖苷酶催化o-连接的聚糖的去糖基化。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述内切糖苷酸酶包含内切-α-n-乙酰半乳糖胺酶(o-糖苷酶)。
23.根据权利要求1所述的方法，其中用所述荧光标记物标记所述样品包含将所述样品加热到约35℃持续10-30分钟。
24.根据权利要求1所述的方法，其中使用还原性溶液或非还原性溶液使所述样品变性。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述还原性溶液包含二硫苏糖醇(dtt)，所述非还原性溶液包含碘乙酰胺(iam)。
26.根据权利要求1所述的方法，其中使所述样品变性包含将所述样品加热到50℃至99℃持续1分钟至60分钟。
27.根据权利要求1所述的方法，其中淬灭所述未反应的荧光标记物包含添加终止溶液。
28.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含平行于所述样品分析参照标准品。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述电泳选自凝胶电泳、等电聚焦、毛细管电泳(ce)和微芯片毛细管电泳(mce)。
30.根据权利要求1所述的方法，其中当与使用在去糖基化后标记的样品生成的电泳图相比时，所述方法导致在小于20kda范围内的减少的游离染料干扰和在电泳图中减少的或不存在的内切糖苷酶峰。
31.根据权利要求30所述的方法，其中当与使用在去糖基化后标记的样品生成的电泳图相比时，所述内切糖苷酶峰减少至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
32.一种确定感兴趣的蛋白质的稳定性的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含fc结构域，所述方法包含：
33.根据权利要求32所述的方法，其中对所述样品进行应激包含对所述样品进行热应激，至少一个冷冻/解冻循环，将所述样品暴露于储存条件，机械搅动所述样品，冻干和再水合所述样品，或将所述样品暴露于光、辐射、单线态氧物质、自由基、高ph条件或低ph条件。
34.根据权利要求33所述的方法，其中对所述样品进行热应激包含将所述样品保持在30℃至45℃持续至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周或至少8周。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述储存条件包含-80℃至-30℃的温度，持续至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或至少30个月；或其中所述储存条件包含2℃至8℃的温度，持续至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月、至少12个月或至少18个月。
36.根据权利要求322所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是包含至少一个附接的聚糖的糖基化的蛋白质。
37.根据权利要求32所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含抗体、抗体片段或scfv。
38.根据权利要求32所述的方法，其中所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵一鸣，H·陈，SC·王，T·里尔曼，G·卡罗，Y·王，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：
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