检测待测水稻是否为科丰６号转基因水稻的方法及其专用试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测待测水稻是否为科丰６号转基因水稻的方法及其专用试剂盒。本发明专利技术提供了针对转基因水稻品系科丰６号外源插入片段的边界序列的特异性引物对和特异性探针。所述特异性引物对是序列表的序列１所示核苷酸和序列表的序列２所示核苷酸组成的引物对。所述特异性探针的核苷酸序列如序列表的序列３所示。本发明专利技术提供的方法，是以待测水稻的总ＤＮＡ为模板，用所述特异性引物和所述特异性探针进行实时荧光ＰＣＲ检测，确定待测水稻是否为转基因水稻品系科丰６号。本发明专利技术提供的试剂盒，包括所述特异性引物对和所述特异性探针。本发明专利技术提供的特异性引物对、特异性探针、试剂盒和方法，可以快速检测待测水稻是否为转基因水稻品系科丰６号，为转基因安全提供好了保证。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测待测水稻是否为科丰6号转基因水稻的方法及其专用试剂
技术介绍
水稻是我国乃至全世界最重要的粮食作物之一，是世界上食用人口最多、历史最悠久的农作物。随着生物技术的发展，转基因技术正广泛地应用于农作物品质改良，已有多个转基因水稻品系进行了环境释放，申请商业化种植。科丰6号是转双价抗虫基因的转基因水稻品系，所导入外源基因是Bt/CpTI。对转基因植物进行品系特异性检测是对转基因植物进行监督管理，保障其健康发展的重要技术基础。转基因植物的外源插入片段的边界序列是转基因植物品系最重要的分子特征之一，它代表了一个转基因事件，一个品系。因此，检测边界序列即品系特异性是保障转基因安全的重要手段。 在转基因生物安全受到越来越广泛关注的当今社会，以生物技术为基础的转基因检测方法成了监管转基因植物及食品的有效手段。实时荧光PCR(Real time PCR)就是其中一个最常用最有效的方法。实时荧光PCR是在常规PCR基础上加入荧光标记探针，通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测实现对起始模板定量及定性的分析，具有高特异性和高灵敏度的优点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测待测水稻是否为科丰6号转基因水稻(转基因水稻品系科丰6号)的方法及其专用试剂盒。 本专利技术提供了针对转基因水稻品系科丰6号外源插入片段边界序列的特异性引物对和特异性探针。 所述特异性引物对是由序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸组成的引物对。 特异性引物对 上游引物5， -ACGTAGTACGTACCGCCGTG-3';序列表的序列1 ; 下游引物5， -AGTGCAGATGCATGAATCGC-3';序列表的序列2。 所述特异性探针可为TaqMan荧光探针，其核苷酸序列如序列表的序列3所示。TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，报告荧光基团连接在探针的5'末端，淬灭荧光基团连接在探针的3'末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5' _3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 所述特异性探针的5'端标记有报告荧光基团，3'端标记有淬灭荧光基团。所述报告荧光基团可为Fam(FAM) 、 Hex (HEX) 、 Tet (TET) 、 Joe (JOE) 、 Vic (VIC) 、 Fite(FITE)、Cy3 (CY3)或Cy5 (CY5)。所述淬灭荧光基团可为Tamra (TAMRA) 、 Rox (R0X) 、 Dabcy (DABCY)、Bhql (BHQ1)或Bhq2 (BHQ2)。特异性探针的核苷酸序列5' -CCGCGCGTTGTACTGAGAACCA-3'。所述特异性探针中，所述报告荧光基团具体可为FAM荧光基团，所述淬灭荧光基团具体可为TAMRA荧光基团。 所述特异性引物对和/或所述特异性探针可应用于制备检测待测水稻是否为转基因水稻品系科丰6号的试剂盒。 本专利技术同时保护一种检测待测水稻是否为转基因水稻品系科丰6号的试剂盒，它包括所述特异性引物对和/或所述特异性探针。 所述试剂盒可应用于检测待测水稻是否为转基因水稻品系科丰6号。 本专利技术同时保护一种检测待测水稻是否为转基因水稻品系科丰6号的方法，是以待测水稻的基因组DNA(总DNA)为模板，其特征在于所述方法为用所述特异性引物对和所述特异性探针进行实时荧光PCR检测，确定待测水稻是否为转基因水稻品系科丰6号。 所述实时荧光PCR的PCR体系中，反应起始时，所述特异性引物对中的两条引物的浓度均可为0. 2 ii mol/L，所述特异性探针的浓度可为0. 1 ii mol/L。 所述实时荧光PCR的参数具体如下5(TC、2min ;95°C、10min ;95 °C、 15s，60°C、lmin，共40个循环。 本专利技术提供的特异性引物对和特异性探针是根据转基因水稻品系科丰6号外源插入片段的边界序列设计的，检测特异性好，用于检测实时荧光PCR灵敏性高。本专利技术提供的检测方法，准确性高、反应灵敏，所需时间短。本专利技术提供的试剂盒使用非常方便。本专利技术提供的特异性引物对、特异性探针、试剂盒和方法，可以快速检测待测水稻是否为转基因水稻品系科丰6号，为转基因安全提供好了保证。附图说明 图1为实时荧光PCR检测品系特异性结果；1 :科丰6号。 图2为本专利技术检测方法灵敏度实验结果。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。 转基因水稻品系科丰6号(GM0+)(转CpTI基因水稻)中国检验检疫科学研究院；戎俊，宋志平，苏军，夏辉，王锋，卢宝荣.Bt/CpTI转基因稻及其非转基因亲本对照在间隔种植条件下的转基因漂移.生物多样性，2006，14(4) :309-314。科丰6号由中国水稻研究所王渭霞提供，是1994年由福建省农业科学院生物技术研究所王锋和中国科学院遗传与发育生物学研究所朱祯共同培育的。 转基因水稻品系Bt63 :中国检验检疫科学研究院；赵卫东，郑文杰，贺艳.荧光PCR方法定性和定量检测BT63转基因大米[J].食品研究与开发，2009， (03) :133-135。 非转基因水稻品系明恢86(GM0-):中国检验检疫科学研究院；张建新，郑家团，谢华安，罗家密，黄显波，邓则勤，吴兰英.水稻新种质明恢86及其系列组合的选育研究[J].植物遗传资源科学，2001， (01) :32-36。。 转基因番茄品系华番1号中国检验检疫科学研究院；黄文胜，陈红运，赵文军，等.转基因延熟番茄华番一号的品系特异性检测方法[J].植物检疫，2005，19(6):321-325。 转基因棉花品系中棉41 :中国检验检疫科学研究院；刘生荣，夏志明，刘党培.双价抗虫棉中棉所41丰产稳产性及其简化栽培技术研究[J].中国农学通报，2005， (03):166-168。 转植酸酶基因玉米品系BVLA430101 :中国检验检疫科学研究院；Rumei Chen，Guangxing Xue， Yunliu Fan et al. ， Transgenic maize plants expressing af皿galphytase gene. Transgenic Res (2008) 17 :633-643。 实施例1、试剂盒的制备 根据科丰6号中外源插入片段的边界序列设计筛选特异性引物对和特异性探针，用于制备试剂盒。 试剂盒由如下特异性引物对和特异性探针(T叫Man探针)组成。 特异性引物对 RB-F(上游引物)5， -ACGTAGTACGTACCGCCGTG-3';RB-R (下游引物)5 ， -AGTGCAGATGCATGAATCGC-3'。 特异性探针5'端用报告荧光基团FAM标记，3'端用淬灭荧光基团TAMRA标记，核苷酸序列为5' -CCGCGCGTTGTAC本文档来自技高网...

【技术保护点】
序列表的序列１所示核苷酸和序列表的序列２所示核苷酸组成的特异性引物对。

【技术特征摘要】
序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸组成的特异性引物对。2. 核苷酸序列如序列表的序列3所示的特异性探针。3. 如权利要求2所述的特异性探针，其特征在于所述特异性探针为T叫Man荧光探 针，所述特异性探针的5'端标记有FAM荧光基团，3'端标记有TAMRA荧光基团。4. 如下(a)或(b)在制备检测待测水稻是否为转基因水稻品系科丰6号的试剂盒中的 应用(a) 权利要求1所述特异性引物对和/或权利要求2所述特异性探针；(b) 权利要求1所述特异性引物对和/或权利要求3所述特异性探针。5. —种检测待测水稻是否为转基因水稻品系科丰6号的试剂盒，它包括如下(c)或(d):(c) 权利要求1所述特异性引物对和/或权利要求2所述特异性探针；(d) 权利要求1所述特异性引物对和/或权利要求3所述特异性探针。6. 权利要求5所述试剂盒在检测待测水稻是否为转基因水稻品系科丰6...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琰，黄新，朱水芳，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]