【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种化合物的生产方法，尤其涉及一种长链二元酸的生产方法，以及对其产量实施调控的方法和生物载体。
技术介绍
1、长链二元酸(lcda)包括分子式为hooc(ch2)ncooh的二元酸，其中n≥7，其在α和ω位各有一个羧基的脂肪族二羧酸。以长链二元酸作为单体原料合成的材料不仅具有较好的性能、经济实用，并且能够节省能源、降低对环境的污染，已被广泛用于精细化工和医药等领域，如合成尼龙、树脂、粉末涂料、高等香料、航空润滑油、高温电解质和防腐剂等。
2、长链二元酸的获取方式主要有植物油裂解法、化学合成法和微生物发酵法三种，长期以来化学合成法占据了主导地位。然而化学合成流程冗长繁琐，环境污染严重，且在合成过程中常会出现断链的情况，无法获得高纯度产品，生产成本高。微生物发酵法主要是利用微生物特有的氧化能力和胞内酶作用的特点来合成二元酸，其具有环境友好、操作简便易控以及产品质量高等特点，发展前景和工业价值广阔，目前已逐渐成为长链二元酸生产的主要途径。
3、采用基因工程的手段来对菌株进行针对性的遗传改造，可以达到控制产物代谢途径的目的，目前已有通过随机诱变和基因工程手段改良二元酸菌种实例，如：通过对cyp52a12基因进行定向进化，筛选到一株在该基因的启动子区域发生碱基突变的菌株，其可以在酸性培养条件下生产长链二元酸(参考中国专利技术专利cn110343675a)。通常情况下，基因表达水平的提高需要借助诱导型启动子的调控、基因组的同源整合或者游离载体的过表达。但该方法存在不可忽视的缺陷：诱导剂的添加增加了发酵成
4、因此，对于微生物发酵法制取长链二元酸的技术，仍需要进一步改进物生物系统，以利于进一步简化操作，降低成本，并对长链二元酸的产量进行调控。
技术实现思路
1、本专利技术的一个目的在于提供一种以sod1基因调控长链二元酸产量的方法，以提高长链二元酸的产量。
2、本专利技术所述sod1基因是超氧化物歧化酶1基因，用于编码超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称sod)，其是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，它具有清除氧化胁迫因素(氧自由基)的功能，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用。
3、在一些具体实施方式中，所述sod1基因的核苷酸序列如seq id no：15所示，或与seq id no：15具有至少约95％的同一性的序列，例如至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.1％、至少约99.2％、至少约99.3％、99.4％、至少约99.5％、至少约99.6％、99.7％、至少约99.8％、至少约99.9％、至少约99.91％、至少约99.92％、至少约99.93％、至少约99.94％、至少约99.95％、或至少约99.96％的序列同一性的序列。序列同一性是指在序列比对和引入缺口后，多核苷酸序列变体的残基与非变体序列的相同的百分比。
4、本专利技术所述长链二元酸(lcda；也称为长链二羧酸或长链二酸、以下或简称为二元酸)包括化学式hooc(ch2)ncooh的二元酸，其中n≥7。优选的，所述长链二元酸包括c9～c22的长链二元酸，优选包括c9～c18的长链二元酸，更优选包括癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种。优选地，所述长链二元酸为十碳至十六碳二元酸中至少一种或多种，优选地，正十碳至十六碳二元酸中至少一种或多种。
5、本专利技术所述发酵生产长链二元酸使用的发酵底物选自长链烷烃、长链脂肪酸或长链脂肪酸酯中的任意一种。长链烷烃属于饱和链烃，是碳氢化合物下的一种饱和烃，其整体构造大多仅由碳、氢、碳碳单键与碳氢单键所构成，其包括化学式ch3(ch2)n ch3的烷烃，其中n≥7。所述发酵底物优选c9～c22的正烷烃，更优选c9～c18的正烷烃，最优选c10、c11、c12、c13、c14、c15或c16的正烷烃。
6、在一些具体实施方式中，将含有靶向sod1基因的识别序列的sgrna和激活因子的载体转染产长链二元酸的微生物实施发酵生产长链二元酸。
7、本专利技术中，所述sgrna包含能够分别与dcas9和激活因子的结合的功能域二级结构，结合后形成crispr复合体，而sgrna作为整个crispr复合体的骨架。同时，sgrna含有的靶向sod1基因识别序列能够识别并结合基因组中与其互补的序列并将dcas9蛋白精准定位在基因组的特定区域。所述激活因子区域含有能与sgrna结合域结合的rna结合区域与可能与rna转录系统相互作用的激活因子区域。当所述载体转染表达时，dcas9、sgrna与激活因子通过其特定区域结合形成crispr复合体，通过sgrna的靶向sod1基因识别序列寻找到基因组中与其互补的区域。
8、专利技术人发现，通过本专利技术提供的14个sgrna的20碱基的识别序列，将crispr复合体引导至目的基因sod1基因所在的上游启动子区域，绑定在crispr复合体上的激活因子会与附近的rna转录酶及其辅助蛋白进行相互作用，使rna转录酶更高效地结合启动子序列，达到提高转录水平从而提高基因表达的目的。本专利技术通过上述crispra技术方式实现sod1基因的过表达，从而调控尤其是提高发酵生产长链二元酸的产量。本专利技术所述的crispra激活技术即利用dcas9结合但不酶切双链dna的能力，在crispr系统中引入一个转录激活因子，并通过grna(guide rna)的靶向作用将该转录激活元件定位在目的基因启动子附近，从而提高其表达水平。
9、在一些具体实施方式中，所述靶向sod1基因的识别序列选自于seq id no：1、seqid no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7、seq idno：8、seq id no：9、seq id no：10、seq id no：11、seq id no：12、seq id no：13和seq idno：14中的一种或几种。
10、在一些具体实施方式中，所述靶向sod1基因的识别序列选自于如下至少一组：
11、第一组：seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seq id no：7所示的序列之一种或几种；
12、第二组：seq id no：3、seq id no：8和seq id no：9所示的序列之一种或几种；
13、第三组：seq id no：2、seq id no：10和seq id no：11所示的序列之一种或几种；
14、第四组：seq id no：1和seq id no：12所示的序列之一种或两种；和
15、第五组本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种调控长链二元酸产量的方法，其特征在于将含有靶向SOD1基因的识别序列的sgRNA和激活因子的载体转染产长链二元酸的微生物实施发酵生产长链二元酸；
2.根据权利要求1所述的调控长链二元酸产量的方法，其特征在于所述靶向SOD1基因的识别序列选自于如下至少一组：
3.根据权利要求1所述的调控长链二元酸产量的方法，其特征在于在产长链二元酸的微生物中表达dCas9表达盒、sgRNA表达盒和激活因子表达盒；其中：
4.根据权利要求1所述的调控长链二元酸产量的方法，所述微生物选自棒状杆菌(Corynebacterium)、白地霉(Geotrichumcandidum)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotroula)、酵母属(Saccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)；优选为酵母菌，更优选为热带假丝酵母(Candida tropicalis)、维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)或清酒假丝酵母。
5.一种微生物，其特征在于靶向含有SOD1基因的识别序列的sgRN
6.根据权利要求5所述的微生物，其特征在于所述微生物含有靶向SOD1基因的识别序列的sgRNA和激活因子的载体；所述靶向SOD1基因的识别序列选自于SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的微生物，其特征在于所述微生物选自棒状杆菌(Corynebacterium)、白地霉(Geotrichumcandidum)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotroula)、酵母属(Saccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)；优选地为酵母菌，更优选为热带假丝酵母(Candida tropicalis)、维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)或清酒假丝酵母。
8.一种调控长链二元酸产量的生物载体，其特征在于所述生物载体含有靶向SOD1基因的识别序列的sgRNA和激活因子。
9.根据权利要求8所述的生物载体，其特征在于所述靶向SOD1基因的识别序列包括SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ IDNO：14所示的序列之一种或几种。
10.一种位于sgRNA表达盒的靶向SOD1基因的识别序列，其特征在于所述的SOD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，所述识别序列选自于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中的一种或几种。
...【技术特征摘要】
1.一种调控长链二元酸产量的方法，其特征在于将含有靶向sod1基因的识别序列的sgrna和激活因子的载体转染产长链二元酸的微生物实施发酵生产长链二元酸；
2.根据权利要求1所述的调控长链二元酸产量的方法，其特征在于所述靶向sod1基因的识别序列选自于如下至少一组：
3.根据权利要求1所述的调控长链二元酸产量的方法，其特征在于在产长链二元酸的微生物中表达dcas9表达盒、sgrna表达盒和激活因子表达盒；其中：
4.根据权利要求1所述的调控长链二元酸产量的方法，所述微生物选自棒状杆菌(corynebacterium)、白地霉(geotrichumcandidum)、假丝酵母属(candida)、毕赤酵母属(pichia)、红酵母属(rhodotroula)、酵母属(saccharomyces)或耶氏酵母属(yarrowia)；优选为酵母菌，更优选为热带假丝酵母(candida tropicalis)、维斯假丝酵母(candidaviswanathii)或清酒假丝酵母。
5.一种微生物，其特征在于靶向含有sod1基因的识别序列的sgrna和激活因子的载体，该微生物用于调控长链二元酸产量。
6.根据权利要求5所述的微生物，其特征在于所述微生物含有靶向sod1基因的识别序列的sgrna和激活因子的载体；所述靶向sod1基因的识别序列选自于seq id no：1、seq idno：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7、seq id no：8、seq id no：9、seq id no：10、seq id no：11、seq id no：12、seq id no：13和seq id no：14中的一种或...
【专利技术属性】
技术研发人员：戎倩倩，刘文波，刘修才，
申请(专利权)人：上海凯赛生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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