【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，涉及入侵生物检测，具体涉及入侵生物的快速检测，尤其涉及一种基于rpa-lfd技术的用于快速检测塔玛亚历山大藻(alexandrium tamarense)的引物对、探针、试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、塔玛亚历山大藻(alexandrium tamarense)隶属甲藻门，横裂甲藻纲，屋甲藻科，亚历山大藻属。该种是引发世界沿海水域有害藻华(harmful algal bloom,hab)的主要优势甲藻之一，也是有毒亚历山大藻属中麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish toxins,pst)的主要产毒种，毒素通过食物链传递后在贝类、鱼类等生物体内大量蓄积，对海洋环境、经济社会和人类健康造成严重损害。世界范围内，有害藻华的分布区域、发生频率和暴发规模等表现出明显上升趋势，其主要原因之一在于船舶压舱水等造成的有害藻华种扩散，巨量的压舱水及其沉积物的排放给外来微藻的入侵提供了极大的便利。大量研究表明，船舶压舱水中亚历山大藻属中如塔玛亚历山大藻等有毒种分布广泛，为其入侵传播带来极大风险。因此，急需建立一种在航运等野外场景中，快速、特异的检测塔玛亚历山大藻的新型方法，对该藻入侵的预警和防控有着重要的实用价值。
2、目前，用于塔玛亚历山大藻检测的方法主要有镜检法、普通pcr、荧光定量pcr、环介导等温扩增等分子生物学检测方法。在亚历山大藻属中，链状亚历山大藻(a.catenella)、地中海亚历山大藻(a.mediterraneum))、塔玛亚历山大藻(a.tamarense))、太平洋亚
3、重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymrpase amplification，rpa)技术是一种快速的动力学过程，无需高温变性，可以在15-40min、37-42℃即恒温发生反应，仅需一对特异性引物即可达到扩增目的，具有高特异性和高灵敏度，是真正意义上的等温扩增。而rpa技术结合横向流动试纸条(latrpal flow dipstick，lfd)，即rpa-lfd法，在rpa技术的基础上，反应更加快速，灵敏度更高，假阳性更少，操作简单且实现肉眼可视化，对实验设备要求低、耗时少，非常适合现场快速检测。但是rpa-lfd法需要设计合适的引物、探针并结合相应的试纸条，以实现rpa法快速扩增和检测。
4、因此，本领域迫切需要开发一种针对野外场景需求，根据塔玛亚历山大藻特征序列设计合适的引物和探针来进行rpa法扩增，通过rpa和横向流动试纸条结合(rpa-lfd)实现快速、灵敏、高特异且适用于现场快速检测塔玛亚历山大藻(alexandrium tamarense)的检测方法。
技术实现思路
1、本专利技术技术属于国家重点研发计划课题“重要入侵水生生物的分子鉴定甄别技术及应用”，课题编号为2022yfc2601301，旨在利用rpa-lfd技术，建立一种针对塔玛亚历山大藻(alexandrium tamarense)的快速检测技术，实现样本随取随做、立等可得，检测结果可及时对于塔玛亚历山大藻的扩散可能发出预警。
2、为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案概述如下：首先基于特征位点设计多组上下游引物和探针，并将其进行排列组合，先进行假阳性(ntc)筛选去除假阳性组，然后使用层析型dna恒温扩增试剂盒进行扩增，并采用lfd试纸条检测，筛选得到最佳引物探针组合；进一步对筛选得到的引物探针组合进行特异性、灵敏性检验，并摸索最佳反应条件；最后采用野外环境样本进行终极验证，可以灵敏特异地检测出野外样品中的塔玛亚历山大藻。
3、进一步，本专利技术采用的具体技术方案如下：
4、本专利技术第一方面，提供了一种塔玛亚历山大藻rpa检测用探针引物组合物，具有如下技术特征：其上游引物和下游引物的序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。探针序列如seq id no.3所示，其中插入有核苷酸类似物四氢呋喃(thf)，优选探针的5’端距离thf≥27-30bp，探针的3’端距离thf≥15bp，进一步优选第30位和第31位碱基之间插入设置四氢呋喃；此外，探针的5'端设置生物素标签，3'端设置c3阻滞位点。
5、探针引物组合物的具体序列如下：
6、上游引物，5’-tgttgtgaacaataaaggtcaatgttttgcattg-3’(seq id no.1)；
7、下游引物，5’-biotin-gttcagcgggtttatgtgcttcacttcacg-3’(seq id no.2)；
8、探针，
9、[5’6-fam]-cgtggggcagacctgtttcgtcatttgatg[thf]ttgatatttgtaaat-[3’-c3spacer](seq id no.3)。
10、上述探针引物组合物进行扩增的特征位点如下所示(seq id no.4)：
11、tgttgtgaacaataaaggtcaatgttttgcattgaacctggatgtcatacagttgtttacaacctaaacatggtttcgtggggcagacctgtttcgtcatttgatggttgatatttgtaaatgtgcacaactgggacaagctgaagacttgcatatgctaagcgtgaagtgaagcacataaacccgctgaac
12、本专利技术第二方面，提供了一种塔玛亚历山大藻rpa检测试剂盒，包含上述所述的探针引物组合物、激活剂、扩增试剂。
13、其中，上游引物、下游引物以及探针均为粉末形式，使用时采用双蒸水进行溶解，浓度均为10μmol/l。激活剂、扩增试剂均选用现有rpa检测试剂盒内产品。
14、本专利技术第三方面，提供了一种塔玛亚历山大藻rpa-lfd检测系统，包括塔玛亚历山大藻rpa检测试剂盒以及lfd试纸条。其中，塔玛亚历山大藻rpa检测试剂盒如上所述，lfd试纸条采用商业化途径购买得到。
15、本专利技术第四方面，提供了采用上述塔玛亚历山大藻rpa-lfd检测系统对塔玛亚历山大藻进行快速检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
16、(1)rpa扩增
17、体系总体积为25μl：将1μl上游引物、1μl下游引物、0.3μl探针、21.45μl待测组织的提取dna作为模板，混合后作为预混液。
18、将预混液转移至含扩增试剂的反应管内，在反应管盖上加1.本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种塔玛亚历山大藻RPA检测用探针引物组合物，其特征在于，上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；探针序列如SEQ ID NO.3所示，其中插入有四氢呋喃THF，且探针的5’端距离THF≥27-30bp，探针的3’端距离THF≥15bp。
2.根据权利要求1所述的塔玛亚历山大藻RPA检测用探针引物组合物，其特征在于，探针序列中第30位和第31位碱基之间插入设置四氢呋喃。
3.根据权利要求1所述的塔玛亚历山大藻RPA检测用探针引物组合物，其特征在于，所述探针的5'端设置生物素标签，3'端设置C3阻滞位点。
4.一种塔玛亚历山大藻RPA检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～3任一项所述的探针引物组合物。
5.根据权利要求4所述的塔玛亚历山大藻RPA检测试剂盒，其特征在于，还包括扩增试剂和激活剂。
6.根据权利要求5所述的塔玛亚历山大藻RPA检测试剂盒，其特征在于，上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/L，探针浓度为10μmol/L。
7.一种塔玛亚历山大藻RPA
8.采用权利要求7所述的塔玛亚历山大藻RPA-LFD检测系统对塔玛亚历山大藻进行快速检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的快速检测的方法，其特征在于，上游引物、下游引物、探针的浓度均为10μmol/L。
10.根据权利要求8所述的快速检测的方法，其特征在于，所述样本拷贝数的预定范围为大于0.001cells/mL。
...【技术特征摘要】
1.一种塔玛亚历山大藻rpa检测用探针引物组合物，其特征在于，上游引物和下游引物的序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示；探针序列如seq id no.3所示，其中插入有四氢呋喃thf，且探针的5’端距离thf≥27-30bp，探针的3’端距离thf≥15bp。
2.根据权利要求1所述的塔玛亚历山大藻rpa检测用探针引物组合物，其特征在于，探针序列中第30位和第31位碱基之间插入设置四氢呋喃。
3.根据权利要求1所述的塔玛亚历山大藻rpa检测用探针引物组合物，其特征在于，所述探针的5'端设置生物素标签，3'端设置c3阻滞位点。
4.一种塔玛亚历山大藻rpa检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～3任一项所述的探针引物组合物。
5.根据权利要求4所述的塔玛亚历山大藻rpa检测试剂盒，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：康伟，李楠楠，高倩，张海燕，李新苍，王翠华，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院东海水产研究所，
类型：发明
国别省市：
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