【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食源性致病菌检测，具体涉及一种基于细菌原位沉积二氧化锰纳米酶的比色传感器及其制备方法和应用。
技术介绍
1、食品安全问题对全球公共卫生构成了严重威胁，而食源性致病菌是引发食品安全问题的主要因素，因此致病菌的检测可作为卫生管理与安全性指标评价的重要手段。传统的细菌检测方法有平板计数法、聚合酶链式反应（pcr）、酶联免疫吸附（elsa）等。其中，平板计数法主要以微生物培养为基础，具有结果直观、准确性好的优点，但是操作复杂、检验周期很长，往往长达5-6天，既费时又费力，同时也需要专业人员的熟练操作，无法满足细菌实时检测的需要。pcr方法灵敏度高、检测时间短，但是容易污染，在细菌的定量分析中准确性较低，容易产生假阳性结果。elisa方法作为一种比色法，具有操作简单、特异性强、重复性好的优点，且依靠肉眼或比色检测仪器就能快速获得分析物的浓度，在细菌的快速检测中具有突出的优势。但这类技术通常需要生物酶的催化介导来获得信号，而生物酶存在易失活、储存条件苛刻、成本高等缺点，进一步限制了其在细菌检测中的广泛应用。
2、目前，为了解决这一问题，采用具有类酶活性的人造纳米酶已成为构建新型比色探针的新思路。纳米酶具有催化活性稳定、易于保存、低成本、可大量制备等优势，可成为一种理想的生物酶替代物。构建基于纳米酶的比色技术，通常需要预先合成纳米酶，采用免疫识别的原理将纳米酶标记到细菌表面，以催化相应的底物获得比色信号，建立信号强度与细菌浓度之间的定量关系。然而，由于细菌尺寸较小，通常为处于0.5-5 μm之间，采用纳米酶对细菌进行
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有生物酶制备难、易失活、成本高的缺点，以及常用的纳米酶标记法导致细菌表面酶负载量低的问题，提供了一种基于细菌原位沉积二氧化锰纳米酶的比色传感器及其制备方法和应用，本专利技术在细菌原位沉积二氧化锰纳米酶，显著地改善了因细菌尺寸、位阻效应引起的细菌与纳米酶结合率较低的问题，提高了比色传感器的信号输出强度。而且二氧化锰不仅类酶活性高，同时兼具过氧化物酶和氧化酶活性，可担任催化剂与氧化剂双重角色，进一步节省了检测成本，能够实现对细菌进行低成本、高特异性、高灵敏的快速检测。
2、本专利技术由如下技术方案实现的：一种基于细菌原位沉积二氧化锰纳米酶的比色传感器，以抗体修饰的免疫磁珠探针作为捕获元件对样品中的大肠杆菌进行分离富集，然后在大肠杆菌表面修饰具有特异性识别作用的核酸适配体，以大肠杆菌作为模板，利用适配体中磷酸基团对锰离子的亲和性，碱性条件下在大肠杆菌原位合成致密的二氧化锰纳米酶；其中：所述核酸适配体序列为：5'-ccggacgcttatgccttgccatctacagagcaggtgtgacgg-3'；
3、所述大肠杆菌原位沉积二氧化锰纳米酶粒径为1930 nm。
4、制备所述基于细菌原位沉积二氧化锰纳米酶的比色传感器的方法，包括以下步骤：
5、（1）制备抗体功能化的免疫磁珠：10mg粒径为200nm的羧基化磁珠经经超声波清洗仪清洗处理，分别用10 ml的超纯水和50 mm、ph为6.0的吗啉乙磺酸缓冲液mes各洗两次，分散于10 mlmes中，再向其中依次加入n-羟基琥珀酰亚胺nhs、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐edc，使nhs和edc的终浓度均为50mm，充分混合，置于细菌摇床中以180 rpm振荡孵育。反应结束后，磁性分离除去过量的nhs与edc，用超纯水洗涤三次，得到nhs活化的磁珠nhs-mb，再将该磁珠分散于10 ml磷酸盐缓冲液（pbs）中，磁珠终浓度为1 mg/ml。然后与5 μg/ml（终浓度）鼠抗大肠杆菌单克隆抗体进行偶联，37℃下，孵育2 h，最后用质量分数为1%的bsa封闭磁珠表面多余的活性位点，室温孵育1 h，得到mb@ab免疫磁珠，分散于10 mlpbs中；
6、（2）mb@ab免疫磁珠捕获大肠杆菌：将大肠杆菌o157:h7分散于2 ml、ph为7.4的pbs缓冲液中，浓度范围为10-107cfu/ml，加入步骤（1）所得mb@ab免疫磁珠，使免疫磁珠的终浓度为0.2 mg/ml；37℃下，150rpm振荡孵育1 h。反应结束后采用10 mm、ph 7.4的pbs洗涤三次，置于磁力架上静置1 min进行分离，除去未结合的靶标，得到2 ml免疫磁珠捕获的大肠杆菌mb@e.coli；
7、（3）在免疫磁珠捕获的大肠杆菌表面修饰核酸适配体：向1 ml分散于pbs的mb@e.coli复合物中，加入10 μl，100 μm可识别大肠杆菌核酸适配体，适配体序列为5'-ccggacgcttatgccttgccatctacagagcaggtgtgacgg-3'，37℃下振荡孵育1 h。反应结束后采用质量分数为0.9%的生理盐水洗涤三次，置于磁力架上静置1 min进行分离，除去未结合的适配体，得到1 ml适配体修饰的磁珠-大肠杆菌复合物mb@e.coli@apt，并用生理盐水稀释至1ml；
8、（4）在大肠杆菌原位沉积二氧化锰纳米酶：向1 ml分散于0.9%生理盐水的mb@e.coli@apt复合物中，加入mncl2溶液（5 mm），在大肠杆菌表面富集mn2+，37℃下振荡反应2h。磁性分离除去多余mn2+后，向反应体系加入naoh溶液，使氢氧化钠终浓度为10mm，mn2+与naoh反应，溶液变成深褐色，在大肠杆菌原位生成二氧化锰微结构。磁分离后，用0.9%生理盐水洗涤三次，得到二氧化锰修饰的大肠杆菌复合物mb@e.coli@mno2。
9、进一步的，步骤（1）中超声波清洗磁珠为800 w功率下超声至磁珠完全分散，振荡孵育为180rpm在室温下振荡30min。
10、步骤（2）中免疫磁珠对大肠杆菌进行捕获，大肠杆菌的菌体浓度为10-107cfu/ml。
11、本专利技术在核酸适配体中，核酸链外侧含有丰富的磷酸基团，且带负电，可与mn2+通过静电作用高效地结合，显著地提高大肠杆菌表面mn2+的含量。此外，mn2+还可与大肠杆菌表面的蛋白等分子进行非特异性吸附作用，这种协同作用可有效地提高mn2+的富集效果。
12、本专利技术还提供了所述基于细菌原位沉积二氧化锰纳米酶的比色传感器在检测大肠杆菌中的应用，包括如下步骤：浓度为0.15 mg/ml，100 μl的tmb显色液中，加入mb@e.coli@mno2复合物50 μl，37℃下孵育15 min，催化氧化tmb生成蓝色的氧化物；然后再向反应体系中加入2 m、50 μl的盐酸终止反应，溶液变为黄色；采用酶标仪或紫外-可见分光光度计测定反应体系在450 nm处的吸光度值，建立吸光度值与大肠杆菌o157:h7数目之间的定量关系。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于细菌原位沉积二氧化锰纳米酶的比色传感器，其特征在于：以抗体修饰的免疫磁珠探针作为捕获元件对样品中的大肠杆菌进行分离富集，然后在大肠杆菌表面修饰具有特异性识别作用的核酸适配体，以大肠杆菌作为模板，利用适配体中磷酸基团对锰离子的亲和性，碱性条件下在大肠杆菌原位合成致密的二氧化锰纳米酶；其中：所述核酸适配体序列为5'-CCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCAGGTGTGACGG-3'；所述大肠杆菌原位沉积二氧化锰纳米酶粒径为1930 nm。
2.制备权利要求1所述于细菌原位沉积二氧化锰纳米酶的比色传感器的方法，其特征在于：包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中超声波清洗磁珠为800 W功率下超声至磁珠完全分散，振荡孵育为180rpm在室温下振荡30min。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中免疫磁珠对大肠杆菌进行捕获，大肠杆菌的菌体浓度为10-107CFU/mL。
5.权利要求1所述基于细菌原位沉积二氧化锰纳米酶的比色传感器在定量检测大肠杆菌O
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：大肠杆菌O157:H7菌体浓度为102～108CFU/mL范围内，拟合得到大肠杆菌浓度响应的工作曲线为Y=0.121X + 0.0599，线性相关系数为R2=0.992，检测限为25 CFU/mL。
...【技术特征摘要】
1.一种基于细菌原位沉积二氧化锰纳米酶的比色传感器，其特征在于：以抗体修饰的免疫磁珠探针作为捕获元件对样品中的大肠杆菌进行分离富集，然后在大肠杆菌表面修饰具有特异性识别作用的核酸适配体，以大肠杆菌作为模板，利用适配体中磷酸基团对锰离子的亲和性，碱性条件下在大肠杆菌原位合成致密的二氧化锰纳米酶；其中：所述核酸适配体序列为5'-ccggacgcttatgccttgccatctacagagcaggtgtgacgg-3'；所述大肠杆菌原位沉积二氧化锰纳米酶粒径为1930 nm。
2.制备权利要求1所述于细菌原位沉积二氧化锰纳米酶的比色传感器的方法，其特征在于：包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中超声波清洗磁珠为800 w功率下超声至磁珠完全分散，振荡孵育为180rpm在室温下振荡30min。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中免疫磁珠对大肠杆菌进...
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