【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及提高豆科植物根瘤菌寡营养适应性的基因工程重组菌株构建方法与应用。
技术介绍
1、根瘤菌是一类能与豆科植物建立起共生固氮关系的革兰氏染色阴性细菌。根瘤菌的生活史主要包括在土壤中的腐生阶段和在豆科植物根瘤中的共生固氮阶段。在腐生阶段，根瘤菌不得不面临土壤内的营养物质匮乏的问题，只有耐受寡营养能力相对强的根瘤菌，才能在贫瘠土壤内更多地存活下来，然后在遇到合适豆科植物宿主时，侵染豆科宿主形成根瘤，再进行共生固氮。液体的根瘤菌菌剂在售卖期间，随着时间的推移，菌剂中的营养成份会逐渐降低，此时如果菌剂中的根瘤菌适应寡营养的能力更强，那么在菌剂中的存活率也将更高，这将有助于接种到豆科植物种子时有更多的活菌数，从而促进结瘤固氮。获得适应于寡营养环境能力更强的根瘤菌，在根瘤菌菌剂生产行业及在豆科植物种植业应用中有着重要的应用价值。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供一种向豆科植物根瘤菌中导入含有腺苷激酶基因 adk的重组质粒，获得基因工程重组根瘤菌，经过改造的根瘤菌具备了适应低镁或低磷寡营养环境，在此低镁或低磷寡营养培养环境中的生长情况好于未经改造的野生型根瘤菌。
2、本专利技术所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
3、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种基因工程重组根瘤菌。
4、本专利技术的重组根
5、所述腺苷激酶的编码基因（简称 adk）编码腺苷激酶（adenosine kinase，简称adk）。
6、本专利技术所述质粒载体使用pbbr1mcs-2（序列见https://www.addgene.org/85168/sequences/），它能够把外源dna或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体。
7、在一个具体实施例中，所述重组根瘤菌含有携带编码腺苷激酶基因 adk的重组质粒载体，所述重组质粒载体的核苷酸序列可为seq id no.3，所述重组质粒载体含有可以表达腺苷激酶基因 adk的表达盒seq id no.1，所述表达盒由 adk上游序列（494bp）（seq idno.1的第1-494位）、编码腺苷激酶基因 adk的序列（993bp）（seq id no.1的第495-1487位）和 adk下游序列（20bp）（seq id no.1的第1488-1507位）组成。
8、所述重组载体pbbr1mcs-2-adk的构建方式如下：是将pbbr1mcs-2质粒载体用限制性内切酶 sami切割，其识别位点（ccc↓ggg，位于seq id no.3的第1882位），然后插入序列表中的seq id no.1序列。seq id no.1经重组质粒载体pbbr1mcs-2-adk在重组根瘤菌中表达后，可表达腺苷激酶，此腺苷激酶的氨基酸序列与seq id no.2所示的氨基酸序列一致。
9、上述重组根瘤菌中，所述腺苷激酶基因来源于根瘤菌。
10、在一个具体的实施例中，所述根瘤菌物种具体为 sinorhizobium fredii，中文名称为费氏中华根瘤菌，菌株编号为ccbau45436。
11、上述重组根瘤菌中，所述腺苷激酶是下述任何一种蛋白质：
12、a1）编码氨基酸序列是seq id no.2的蛋白质；
13、a2）将a1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1）所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有腺苷激酶活性的蛋白质；
14、a3）在a1）或a2）的n端和/或c端连接标签得到的具有腺苷激酶活性的融合蛋白质。
15、上述重组根瘤菌中，所述腺苷激酶的编码基因为下述任一种序列：
16、b1）核苷酸序列如seq id no.1的第495至1487位所示的dna分子；
17、b2）与b1）中限定的核苷酸序列具有75％以上的同一性且编码所述腺苷激酶的dna分子；
18、b3）在严格条件下与b1）-b2)中任一限定的核苷酸序列杂交，且编码所述腺苷激酶的dna分子。
19、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的编码腺苷激酶的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术的腺苷激酶质的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要编码腺苷激酶且具有腺苷激酶功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。
20、这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的编码腺苷激酶的核苷酸序列具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
21、上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
22、本专利技术还提供了构建前文所述的重组根瘤菌的方法，所述方法为通过调控前文所述腺苷激酶的编码基因的表达，或调控所述腺苷激酶的活性或含量，得到过表达腺苷激酶的重组根瘤菌。
23、上述方法中，所述调控所述腺苷激酶的编码基因的表达或调控所述腺苷激酶的活性或含量的方法可为下述任一种：
24、c1）向目的微生物中导入所述腺苷激酶的编码基因；
25、c2）向目的微生物中导入氨基酸序列是seq id no.2的蛋白的编码基因；
26、c3）向目的微生物中导入所述可以表达腺苷激酶的编码基因的重组载体。
27、本专利技术还提供了前文所述的重组根瘤菌在下述任一种中的应用：
28、d1）在提高微生物低镁或低磷寡营养生长环境中生长性能的应用。
29、d2）在构建重组根瘤菌中的应用。
30、本专利技术还提供了氨基酸序列为seq id no.2的腺苷激酶在下述任一种应用：
31、e1）在提高微生物低镁或低磷寡营养生长环境中生长性能的应用；
32、e2）在构建重组根瘤菌中的应用。
33、本专利技术中，所述低镁环境具体可为镁离子的含量为1 μm，如添加1 μm mgso4，相对于正常培养基中的常镁或高镁浓度，即2 mm mgso4。
34、本专利技术中，所述低磷时培养基中的磷本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.重组根瘤菌，其特征在于：所述重组根瘤菌是向野生型根瘤菌导入了带有编码腺苷激酶编码基因的序列得到的菌株，所述带有编码腺苷激酶编码基因的序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的重组根瘤菌，其特征在于：所述腺苷激酶基因来源于根瘤菌。
3.根据权利要求1或2所述的重组根瘤菌，其特征在于：所述腺苷激酶是下述任一蛋白质：
4.根据权利要求1-3任一所述的重组根瘤菌，其特征在于：所述腺苷激酶的编码基因为下述任一种：
5.构建权利要求1-4中任一所述的重组根瘤菌的方法，所述方法为通过调控权利要求1-4中任一所述腺苷激酶的编码基因的表达，或调控所述腺苷激酶的活性或含量，得到过表达腺苷激酶的重组根瘤菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述调控所述腺苷激酶的编码基因的表达或调控所述腺苷激酶的活性或含量的方法为下述任一种：
7.权利要求1-4任一所述的重组根瘤菌在下述任一种中的应用：
8.氨基酸序列为SEQ ID No.2的腺苷激酶在下述任一种应用：
9.生物材料，其特征在
...【技术特征摘要】
1.重组根瘤菌，其特征在于：所述重组根瘤菌是向野生型根瘤菌导入了带有编码腺苷激酶编码基因的序列得到的菌株，所述带有编码腺苷激酶编码基因的序列如seq id no.1所示。
2.根据权利要求1所述的重组根瘤菌，其特征在于：所述腺苷激酶基因来源于根瘤菌。
3.根据权利要求1或2所述的重组根瘤菌，其特征在于：所述腺苷激酶是下述任一蛋白质：
4.根据权利要求1-3任一所述的重组根瘤菌，其特征在于：所述腺苷激酶的编码基因为下述任一种：
5.构建权利要求1-4中任一所述的重...
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