一种快速提取水菜花浮水叶原生质体的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速提取水菜花浮水叶原生质体的方法，属于植物分子细胞生物学技术领域，所述快速提取水菜花浮水叶原生质体的方法，包括以下步骤：水菜花浮水叶水洗，切成小叶块，于浸泡于甘露醇溶液的状态下，切成叶丝；叶丝与酶解液混合，避光酶解处理，然后加入W5溶液，细胞筛过滤，滤出液第一离心处理，得初提物；初提物与W5溶液混合，重悬，第二离心处理，重复处理2次，得原生质体粗提物；原生质体粗提物与W5溶液混合，冰上放置20～40min，第三离心处理，弃上清，得原生质体，原生质体重悬于MMG溶液中。本发明专利技术利用纤维素酶R10和果胶酶R10降解细胞壁，并使用甘露醇作为渗透物质，保持了制备所得原生质体的完整性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物分子细胞生物学，尤其涉及一种快速提取水菜花浮水叶原生质体的方法。

技术介绍

1、水菜花是水鳖科海菜花属一种濒危大型水生植物，近年来，由于人类活动对其生存环境的干扰和破坏，其分布范围逐渐减少，种群数量也日益减少，1999年被收录入《国家重点保护野生植物名录(第一批)》ⅱ级保护物种，2004年被录入《中国物种红色名录(第一卷·红色名录)》。因此，为了保护濒危水生植物水菜花，开展其基础生物学特性和保护策略的研究工作，具有非常重要的意义。

2、水菜花具有典型的发育调控异形叶：沉水叶和浮水叶，而国内外对于水生植物发育调控异形叶的无机碳利用策略研究甚少。目前认为水菜花沉水叶和浮水叶的无机碳利用策略不一样，沉水叶以利用水中的无机碳源为主，浮水叶不仅可以利用水中的无机碳，还可以直接以空气中的co2为无机碳源；并且其无机碳利用策略会受水中无机碳浓度的影响，其中c4途径、cam途径受低浓度co2诱导。但是，水菜花的转基因体系尚未建立，关于其无机碳利用策略的研究缺乏关键的分子生物学证据，而基于单细胞培养是建立转基因体系的一种有效途径，因此分离和纯化本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种快速提取水菜花浮水叶原生质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中所述小叶块长为4cm，宽为2cm；步骤(1)中所述甘露醇溶液的浓度为0.3M；步骤(1)中所述叶丝宽为1mm。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中所述叶丝与酶解液混合比为0.4～0.6g：10mL；步骤(2)中所述酶解处理的温度为25～30℃。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(2)中所述酶解液包括：纤维素酶R10、果胶酶R10、甘露醇、KCl、MES、CaCl2和BSA中的一种或多种。

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【技术特征摘要】

1.一种快速提取水菜花浮水叶原生质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中所述小叶块长为4cm，宽为2cm；步骤(1)中所述甘露醇溶液的浓度为0.3m；步骤(1)中所述叶丝宽为1mm。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中所述叶丝与酶解液混合比为0.4～0.6g：10ml；步骤(2)中所述酶解处理的温度为25～30℃。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(2)中所述酶解液包括：纤维素酶r10、果胶酶r10、甘露醇、kcl、mes、cacl2和bsa中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(2)所述酶解液中所述纤维素酶r10的质量浓度为1～1.5％，所述果胶酶r10的质量浓度为0.6～0.8％，所述甘露醇的浓度为0.3m，所述kcl浓度为20mm，所述mes浓度为20mm，所述cacl2浓度为10mm，所述bsa的质量浓度为0.1％。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中所述w5溶液进行4℃预冷处理，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭攀阳，尹黎燕，黄家权，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：