【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞生物技术、免疫学，具体地指一种猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5d7及其应用。
技术介绍
1、猪流行性腹泻(ped)会导致猪急性腹泻、呕吐、脱水、精神沉郁和体重减轻，这种肠道疾病具有高传染性和高死亡率，是目前全球传播较广的一种猪的传染病，我国将其列为二类动物传染病。猪流行性腹泻在多个国家流行，并有愈演愈烈的趋势，对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrheavirus，简称pedv)的快速诊断是防控ped流行的前提和基础，各国都加强了对流行性腹泻的监控。
2、目前防控pedv最主要的方式是疫苗免疫，免疫形式包括主动免疫和被动免疫。因新生仔猪免疫系统不健全，母猪乳汁中的母源抗体是其抵抗pedv感染，增强免疫保护力的重要来源。因此检测血清或乳汁中的抗体水平，评价疫苗的免疫效果，在pedv的防控中至关重要。
3、目前pedv疫苗免疫效果的评价方法、快速检测pedv抗体水平的方法还不够完善，找到一对结合能力强、反应性好的抗原抗体对，对于相关疾病的早期发现、早期治疗、改善预后具有重要的意义。
4、因此研制一株效价高、特异性好、稳定性好的中和抗体，对于pedv的防控有重要意义。
技术实现思路
1、为克服上述技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5d7及其应用，该单克隆抗体与抗原结合能力强、反应性好、特异性好，可用于建立pedv抗体检测方法，能够有效评价pedv抗体水平。
2、为实现上
3、一种猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5d7，所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5d7包括轻链可变区的3个互补决定区lcdr-1、lcdr-2、lcdr-3和重链可变区的3个互补决定区hcdr-1、hcdr-2和hcdr-3；所述lcdr-1、lcdr-2、lcdr-3、hcdr-1、hcdr-2、hcdr-3的氨基酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:10、seq id no:11、seq idno:12所示；
4、所述轻链可变区含有轻链框架区lfr-1、lfr-2、lfr-3、lfr-4；所述重链可变区含有重链框架区hfr-1、hfr-2、hfr-3、hfr-4；所述lfr-1、lfr-2、lfr-3、lfr-4、hfr-1、hfr-2、hfr-3、hfr-4的氨基酸序列分别如seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16所示。
5、优选地，所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5d7的轻链可变区的氨基酸序列、重链可变区的氨基酸序列分别如seq id no:8和seq id no:17所示；编码所述单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列、重链可变区的核苷酸序列分别如seq id no:9和seq id no:18所示。
6、本专利技术还提供了包含上述核苷酸序列的重组表达载体、包含上述重组表达载体的宿主细胞、分泌上述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5d7的杂交瘤细胞株。
7、上述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5d7的制备方法，所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5d7为通过猪流行性腹泻病毒yn15的s1蛋白作为免疫原制备获得。
8、本专利技术还提供了上述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5d7在猪流行性腹泻病毒抗体检测、检测试剂或试剂盒中的应用。
9、一种猪流行性腹泻病毒阻断elisa抗体检测试剂盒，包括上述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5d7。
10、优选地，上述试剂盒还包括猪流行性腹泻病毒s1蛋白、洗涤液、封闭液、tmd底物显色液和显色终止液。
11、一种猪流行性腹泻病毒抗体阻断elisa检测方法，使用hrp标记的单克隆抗体作为酶标抗体用于检测待检样品中的猪流行性腹泻病毒抗体；所述单克隆抗体为上述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5d7。
12、优选地，所述待检样品为血清、乳汁。
13、优选地，上述猪流行性腹泻病毒抗体阻断elisa检测方法具体包括以下步骤：
14、(1)包被：将纯化的猪流行性腹泻病毒s1蛋白用碳酸盐包被缓冲液稀释至0.5μg/ml，每孔100μl包被于96孔酶标板中，置于4℃孵育过夜。
15、(2)洗涤：将包被好的板用pbst洗3次，每次3min，最后一次拍干。
16、(3)封闭：加入1％的bsa，每孔200μl，37℃封闭1h。
17、(4)洗涤：洗涤方式同步骤(2)。
18、(5)被检血清样品：将被检血清、阳性血清和阴性血清用pbs按照1﹕25进行稀释，每孔100μl，37℃作用1.5h。
19、(6)洗涤：洗涤方式同步骤(2)。
20、(7)酶标抗体：将酶标抗体按照1﹕1000稀释后加入酶标板中，每孔100μl，37℃作用2h。
21、(8)显色：加入tmb显色液，每孔50μl，37℃避光作用15min。
22、(9)终止反应：加入2m h2so4终止液，每孔50μl，终止反应。
23、(10)读数：终止反应后，在酶标仪中测定od450nm的值。
24、相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
25、本专利技术通过真核表达蛋白制备单克隆抗体，筛选出一株具有中和活性的猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5d7，该抗体效价高，特异性良好，阻断率高，其ic50为3.125μg/ml，适用于pedv抗体检测方法的建立，并对该抗体进行序列测定分析其轻重链可变区的3个互补决定区以及轻重链可变区框架区。
26、本专利技术建立的pedv抗体阻断elisa检测方法能够对血清、乳汁中的中和抗体进行定量检测，该方法检测限度为1﹕2560，批间差异系数与批内差异系数均小于10％，符合率良好，运用该方法能够评价疫苗的免疫效果，在ped的防控中至关重要。
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1.一种猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5D7，其特征在于：所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5D7包括轻链可变区的3个互补决定区LCDR-1、LCDR-2、LCDR-3和重链可变区的3个互补决定区HCDR-1、HCDR-2和HCDR-3；所述LCDR-1、LCDR-2、LCDR-3、HCDR-1、HCDR-2、HCDR-3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:10、SEQ ID No:11、SEQ ID No:12所示；
2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5D7，其特征在于：所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5D7的轻链可变区的氨基酸序列、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID No:8和SEQ ID No:17所示；编码所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5D7的轻链可变区的核苷酸序列、重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID No:9和SEQ ID No:18所示。
3.权利要求1或2所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5D7的制备方法，其特征在于：所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5D7为
4.杂交瘤细胞株，其特征在于：分泌权利要求1或2所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5D7。
5.权利要求1或2所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5D7在猪流行性腹泻病毒抗体检测、检测试剂或试剂盒中的应用。
6.一种猪流行性腹泻病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5D7。
7.根据权利要求6所述的猪流行性腹泻病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：还包括猪流行性腹泻病毒S1蛋白、封闭液、TMD底物显色液和显色终止液。
8.一种猪流行性腹泻病毒抗体阻断ELISA检测方法，其特征在于：使用HRP标记的单克隆抗体作为酶标抗体用于检测待检样品中的猪流行性腹泻病毒抗体；所述单克隆抗体为权利要求1或2所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5D7。
9.根据权利要求8所述的猪流行性腹泻病毒抗体阻断ELISA检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的猪流行性腹泻病毒抗体阻断ELISA检测方法，其特征在于：所述猪流行性腹泻病毒S1蛋白的包被浓度为0.5μg/mL；待检样品稀释度为1﹕25；酶标抗体稀释度为1﹕1000。
...【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5d7，其特征在于：所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5d7包括轻链可变区的3个互补决定区lcdr-1、lcdr-2、lcdr-3和重链可变区的3个互补决定区hcdr-1、hcdr-2和hcdr-3；所述lcdr-1、lcdr-2、lcdr-3、hcdr-1、hcdr-2、hcdr-3的氨基酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12所示；
2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5d7，其特征在于：所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5d7的轻链可变区的氨基酸序列、重链可变区的氨基酸序列分别如seq id no:8和seq id no:17所示；编码所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5d7的轻链可变区的核苷酸序列、重链可变区的核苷酸序列分别如seq id no:9和seq id no:18所示。
3.权利要求1或2所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5d7的制备方法，其特征在于：所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体5d7为通过猪流行性腹泻病毒yn15的s1蛋白作为免疫原制备获得。
...【专利技术属性】
技术研发人员：罗锐，杨思琪，金卉，王荡，李珂，周鹏，陈栋，孙煜，周红波，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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