【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物领域，更具体地，涉及一种检测细胞膜蛋白-配体相互作用的elisa方法。
技术介绍
1、膜蛋白通常是指细胞膜上的蛋白，约占细胞膜成分的30％，是生物膜功能的主要承担者。膜蛋白约有50多种，包括多种酶、受体、运输蛋白等，赋予了细胞膜的大部分功能，如参与细胞信号转导、物质运输、代谢、分裂、分化等。目前，膜蛋白的检测方法有检测egfp载体表达或抗体免疫荧光标记(if)、免疫印迹法(wb)与酶联免疫吸附技术(elisa)等，前者由于膜蛋白通常都不会只在细胞膜上表达，在细胞内也有大量表达，容易对结果造成干扰。而免疫印迹法主要应用于蛋白定性与半定量，无法准确定量，同时还伴有出现非特异性条带、膜本底差、显色不好等缺点。
2、elisa全称为酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay)，是一种被广泛应用于生物医药、生物化学领域的免疫分析技术，通常用于测量生物样品中的抗体或抗原，包括蛋白质或糖蛋白。类似于其他免疫检测方法，elisa依靠抗体与目标蛋白的结合来完成检测，可用于临床中对病毒感染、食物过敏原、毒性和癌症的诊断检测。相比于上述方法，elisa法具有灵敏、特异性强、稳定等优点。间接elisa法的流程基本类似于直接elisa法，但间接elisa法中与包被好的抗原结合的不是酶标抗体，而是非酶标的一次抗体，另外再引入经过酶标的二次抗体与一次抗体特异性结合，最后加入底物显色并判读结果。在实验过程中，抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键因素。elisa所用抗原包括天然抗原、重组抗原
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种检测细胞膜蛋白-配体相互作用的间接elisa方法，不需要繁琐的蛋白纯化过程，只需利用细胞高表达膜蛋白在细胞板底部即可一步完成蛋白包被步骤，具有操作简单，特异性强的优点，同时极大地降低了以往方法纯化蛋白所需的经济和时间成本。即，本申请提供的方法能够提高细胞膜蛋白的检测效率，同时省去蛋白分离纯化等步骤，大大降低检测的时间和经济成本。
2、本申请提供了一种检测细胞膜蛋白-配体相互作用的elisa方法，包括以下步骤：
3、s1、在细胞培养板中培养细胞；
4、s2、将膜蛋白基因导入所述细胞，使所述膜蛋白基因在细胞膜表面表达；
5、s3、弃去所述细胞培养板中的培养液，设置对照孔和多个样品孔，在所述对照孔中加入pbs，在所述多个样品孔中加入不同稀释梯度的一次抗体溶液，孵育，洗涤；
6、s4、弃去所述对照孔和所述多个样品孔中的液体，洗涤；加入稀释的带小鼠fc标签的蛋白溶液；如果待测配体并不是带小鼠fc标签的蛋白溶液时，加入预设浓度带小鼠fc标签的蛋白的同时加入不同浓度的待测配体溶液，孵育，洗涤；预设浓度为能够与全部ace2蛋白结合即可；
7、s5、在所述对照孔和所述多个样品孔中加入混合显色液，孵育；
8、s6、在所述对照孔和所述多个样品孔中加入终止液，读取od值。
9、在一些实施例中，在步骤s1中，所述细胞为贴壁细胞；细胞浓度为1×105个/孔。
10、在一些实施例中，在步骤s2中，将膜蛋白基因导入所述细胞包括通过病毒感染法或阳离子脂质体法将膜蛋白基因导入所述细胞。
11、在一些实施例中，在步骤s3中，所述不同稀释梯度为6个不同的带小鼠fc标签的蛋白溶液；如果待测配体非此带小鼠fc标签的蛋白溶液时，加入一定浓度带小鼠fc标签的蛋白的同时加入不同浓度待测配体溶液，孵育，洗涤，孵育的条件为：在37℃下孵育1h；洗涤步骤使用的溶液为1×pbst；洗涤次数为3次。
12、在一些实施例中，在步骤s4中，所述二次抗体带有hrp标签，孵育条件为在37℃下避光孵育30min。
13、在一些实施例中，在步骤s5中，所述混合显色液包括显色液a和显色液b，所述显色液a的制备步骤为将5mg 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶解于25ml二甲基亚砜；所述显色液b为含0.01％h2o2的底物缓冲液；所述显色液a和所述显色液b等体积混合得到所述混合显色液；孵育条件为室温孵育15-20min。
14、在一些实施例中，在步骤s6中，所述终止液为浓度为2m的硫酸溶液；读取od值的波长为450nm。
15、在一些实施例中，所述避光孵育采用锡纸包裹细胞培养板孵育。
16、在一些实施例中，所述底物缓冲液为ph5.0的柠檬酸缓冲液，所述柠檬酸缓冲液通过混合以下溶液得到：0.1mol/l柠檬酸6.075ml，0.2mol/l na2hpo46.425ml，h2o 12.5ml。
17、本申请提供的检测细胞膜蛋白-配体相互作用的elisa方法省去了蛋白纯化的时间和经济成本，同时仍具有很强的特异性，为一种更加经济实用的检测方法。另外，本申请提供的检测细胞膜蛋白-配体相互作用的elisa方法利用细胞培养代替蛋白包被步骤，操作简单，省时省力。由于使用了带小鼠fc标签的蛋白，减少了孵育一次抗体及洗板的步骤，降低了对细胞培养板中细胞的洗刷，在多次验证胞膜蛋白-配体结合情况下，具有较好的稳定性和可重复性，为一种更加简单便捷的检测方法。
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1.一种检测细胞膜蛋白-配体相互作用的ELISA方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测细胞膜蛋白-配体相互作用的ELISA方法，其特征在于，在步骤S1中，所述细胞为贴壁细胞；细胞浓度为1×105个/孔。
3.根据权利要求1所述的检测细胞膜蛋白-配体相互作用的ELISA方法，其特征在于，在步骤S2中，将膜蛋白基因导入所述细胞包括通过病毒感染法或阳离子脂质体法将膜蛋白基因导入所述细胞。
4.根据权利要求1所述的检测细胞膜蛋白-配体相互作用的ELISA方法，其特征在于，在步骤S3中，所述不同稀释梯度为6个不同的带小鼠Fc标签的蛋白溶液；孵育的条件为：在37℃下孵育1h；洗涤步骤使用的溶液为1×PBST；洗涤次数为3次。
5.根据权利要求1所述的检测细胞膜蛋白-配体相互作用的ELISA方法，其特征在于，在步骤S4中，所述二次抗体带有HRP标签，孵育条件为在37℃下避光孵育30min。
6.根据权利要求1所述的检测细胞膜蛋白-配体相互作用的ELISA方法，其特征在于，在步骤S5中，所述混合显色液包括显色液A
7.根据权利要求1所述的检测细胞膜蛋白-配体相互作用的ELISA方法，其特征在于，在步骤S6中，所述终止液为浓度为2M的硫酸溶液；读取OD值的波长为450nm。
8.根据权利要求5所述的检测细胞膜蛋白-配体相互作用的ELISA方法，其特征在于，所述避光孵育采用锡纸包裹细胞培养板孵育。
9.根据权利要求6所述的检测细胞膜蛋白-配体相互作用的ELISA方法，其特征在于，所述底物缓冲液为pH5.0的柠檬酸缓冲液，所述柠檬酸缓冲液通过混合以下溶液得到：0.1mol/L柠檬酸6.075ml，0.2mol/L Na2HPO46.425ml，H2O 12.5ml。
...【技术特征摘要】
1.一种检测细胞膜蛋白-配体相互作用的elisa方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测细胞膜蛋白-配体相互作用的elisa方法，其特征在于，在步骤s1中，所述细胞为贴壁细胞；细胞浓度为1×105个/孔。
3.根据权利要求1所述的检测细胞膜蛋白-配体相互作用的elisa方法，其特征在于，在步骤s2中，将膜蛋白基因导入所述细胞包括通过病毒感染法或阳离子脂质体法将膜蛋白基因导入所述细胞。
4.根据权利要求1所述的检测细胞膜蛋白-配体相互作用的elisa方法，其特征在于，在步骤s3中，所述不同稀释梯度为6个不同的带小鼠fc标签的蛋白溶液；孵育的条件为：在37℃下孵育1h；洗涤步骤使用的溶液为1×pbst；洗涤次数为3次。
5.根据权利要求1所述的检测细胞膜蛋白-配体相互作用的elisa方法，其特征在于，在步骤s4中，所述二次抗体带有hrp标签，孵育条件为在37℃下避光孵育30min。
6.根据权利要求1所述的检测细胞膜蛋白-配体...
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