本发明专利技术提供一种核酸扩增用器件。所述核酸扩增用器件能够在试样的独立
化扩增过程的前后，维持靶分子的存在比例，得到能应用于基因表达解析的高
精度的解析结果。本发明专利技术的核酸扩增用器件具有平面状地配置多个微小反应池
的结构，所述反应池具有1组微珠保持空间和试剂反应空间，所述微珠保持空
间能够仅保持1个解析用微珠，所述试剂反应空间不保持微珠但具有能够进行
试剂反应的充分的容积。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因解析技术。更详细地讲，涉及核酸扩增用器件，所述核酸扩增用器件在独立地在微珠等固相表面对作为测定对象的mRNA等靶分子进 行扩增时，使这些靶分子的利用率提高，消除靶分子的混合或过度扩增。
技术介绍
在基因序列解析技术中，对于作为测定对象的mRNA或DNA片段等靶分 子，在保存其序列信息的状态下对其进行扩增是重要的技术。作为其一例，有 利用焦磷酸测序(Pyrosequencing)的序列解析系统(非专利文献1 )。该系统 中，为了使作为测定对象的靶分子在1个微珠表面上仅为1种，需要实现靶分 子的独立扩增。另一方面，还有利用通过油中的水溶液胶束进行的分离作为实现独立扩增 的要素技术的方法(非专利文献2)。该方法中，通过2相(水相、油相)的 搅拌，形成水溶液胶束，在该胶束内保持微珠、靶分子和核酸扩增所需要的一 组试剂等，通过扩增仪在微珠表面扩增核酸。因此，理想的情况是在l个胶束 内放入微珠和靶分子各l个。但是，对于全部胶束，实现这样的条件是不可能 的，通常存在如下情况，即，有微珠但不含靶分子的胶束、反之有靶分子但没 有微珠的胶束、进而放入有多个微珠和耙分子的胶束、微珠和耙分子都没有放 入的胶束等(非专利文献2)。在1个胶束内放入有多个靶分子的情况下，扩 增时发生它们的混合存在，使序列解析成为不可能。另外，尽管胶束中存在靶 分子，但在没有放入孩史珠的情况下，靶分子不能在微珠表面扩增，导致靶分子 的损失。进而，在胶束内放入有多个微珠的情况下，由于来自相同靶分子的扩 增在多个微珠表面发生，因此产生过度解析的问题。进而，还报告有在载玻片等平板表面上生成部分的聚集区域(集落)的扩 增方法(非专利文献3)。该方法是，使用在平板上固定有扩增用引物的物质， 以确保某种距离的浓度分布使靶分子与平板上的引物进行互补链结合，之后，利用周边的引物，反复进行引物延伸和桥状的互补链结合，从而形成扩增物质 的集落。该方法的问题是，由于对平面上的引物的互补链结合的效率低，因此 需要过量的靶分子，并且如果多个靶分子接近进行互补链结合时，则扩增物的 集落结合，发生混合。非专利文献1: NATURE, Vol. 437, pp.376-380 (2005) 非专利文献2: PNAS， VoU00， No. 15， p8817-8822 (2003) 非专利文献3: Cell, Vol.l29， p823-837 (2007)
技术实现思路
专利技术要解决的问题如上所述，现有技术中，就靶分子的扩增来说，存在如下问题(1)由于 水滴(胶束)内没有微珠，因此不能对该胶束内的靶分子进行解析；(2)胶束 内存在多个微珠，生成多个固定来自靶分子的扩增产物的微珠，形成过度解析。 因此，在称为扩增工序的解析前处理的前后，不能维持靶分子的存在比例，即 使统计性地解析得到的序列信息的频度，也不能得知所用的靶分子的比例，难 以应用于基因表达解析。另夕卜，各胶束的大小即容量依赖于胶束生成时的搅拌，因此其大小的变动 很大。故此,扩增反应时的试剂量变动，结果，得到的微珠上的扩增物的量也 有很大变动。因而，例如，在利用上述焦磷酸测序的解析中，每个微珠的信号 量大幅变动，因此存在检测系统的动态范围(dynamic range)不足，存在发生 由检测限以下或超出检测灵敏度引起的无法检测的事故这样的问题。本专利技术的课题是解决这些现有技术的问题，提供高效率高精度的核酸扩增 用器件。解决问题的手段本专利技术人等，为了解决上述问题，想出了能够使直径数十微米以下的微小 微珠一个一个地反应、大规才莫的平行扩增用器件。也就是说，本专利技术涉及核酸扩增用器件，作为一个例子，其为平面状配置 多个反应池的核酸扩增用器件，所述反应池具有1组能够保持1个第1微珠的 第1空间和与所述第1空间相对的第2空间，该核酸扩增用器件的特征在于， 按照使所述第l微珠不位于从所述平面状的面看时的所述第1空间和所述第2空间不重叠的区域的方式来配置所述第1空间和所述第2空间。某实施方式中，纟敫珠保持空间(能够保持1个第14鼓珠的第1空间)和试剂反应空间(相对的第2空间)直接上下连接。这时，相对于1微珠的直径r， 各空间的高度和直径满足以下条件，从而按照使1个微小反应池保持1个微珠 的方式来构成反应池(微小反应池)1) 微珠保持空间的高度大于1/2r且小于3/2r;2) 微珠保持空间的高度和试剂保持空间的高度之和为2r以下； 3 )微珠保持空间的直径大于r且小于2r。微珠保持空间和试剂反应空间也可以用细管连接，所述细管具有比微珠的 直径小的直径。本专利技术还提供一种核酸扩增用器件，其具有这样的结构平面状配置多个 微小反应池，所述微小反应池具有1组能够仅保持1个解析用微珠的微珠保持 空间1、不保持微珠的试剂反应空间和能够仅保持1个与所述解析用微珠不同 种类的微珠的微珠保持空间2。该器件，例如可以使预先固定有试样核酸的微 珠保持于微珠保持空间2。某个实施方式中，试剂反应空间位于微珠保持空间1和微珠保持空间2 之间。此时，对于微珠的直径r,各空间的高度和直径满足以下条件，从而按 照使1个微小反应池保持1个微珠的方式来构成1 )微珠保持空间1和2的高度大于1/2r且小于3/2r;2 )微珠保持空间1或2的高度和试剂保持空间的高度之和为2r以下；3 )微珠保持空间1和2的直径大于r且小于2r。另外的实施方式中，微珠保持空间1和微珠保持空间2用细管连接，所述 细管具有比微珠的直径小的直径。本专利技术的器件中，所述微小反应池能够通过组装而流通池(flowcell)化， 另外，通过设置覆盖其开口面的部件(上板)，各微小反应池的独立化成为可 能。该覆盖开口面的部件(上板)最好具有含密封材料等弹性材料的层。另夕卜，微小反应池的与流通池接触的空间的壁面不一定必须是垂直的，通 过按照朝流通池侧打开来使其倾斜，可以使多余的微珠容易流出。专利技术的效果根据本专利技术，在大规模平行型核酸序列技术中，能够减少不实施解析的靶 分子，提高应用于基因表达解析时的解析精度。另外，能够减少大规模平行解 析时不能解析的试样，使解析效率提高。 附图说明图l是器件的部分截面图。图2是器件的整体图。图3是微小反应池的扩大图。图4是将器件流通池化的组装图。图5是说明微珠被保持于微珠保持空间的构造的图。图6是说明微珠保持及流出的图。图7是说明试剂反应空间的直径大、微珠保持空间的第1微珠和第2微珠 不接触时，微珠保持及流出的图。图8是说明试剂反应空间的壁面倾斜时，微珠保持及流出的图。图9是表示微小反应池的独立化的图。图10是表示上板具有2层结构的构成的图。图ll是微小反应池被独立化的器件的整体图。图12是说明使用2种微珠的器件的微珠保持及流出的图。图13是说明第2种微珠比第l种微珠大时，微珠保持及流出的图。图14是将2种微珠1个1个地独立化的微小反应池的图。图15是说明第2种微珠比第l种微珠小时，微珠保持及流出的图。图16是说明2个空间用细管连接的结构的微小反应池的图。图17是表示器件的流通池化的图。图18是表示微小反应池的独立化的图。图19是表示第l种微珠保持空间和第2种微珠保持空间用细管连接的构 成的图。图20是说明第1种微珠保持空间和第2种微珠保持空间用细管连接的构 成中，微本文档来自技高网...
【技术保护点】
核酸扩增用器件，其为平面状地配置多个反应池的核酸扩增用器件，所述反应池具有１组能够保持１个第１微珠的第１空间和与所述第１空间相对的第２空间，该核酸扩增用器件的特征在于，按照使所述第１微珠不位于从所述平面状的面看时的所述第１空间和所述第２空间不重叠的区域的方式来配置所述第１空间和所述第２空间。
【技术特征摘要】
2008.2.21 JP 2008-0402481.核酸扩增用器件，其为平面状地配置多个反应池的核酸扩增用器件，所述反应池具有1组能够保持1个第1微珠的第1空间和与所述第1空间相对的第2空间，该核酸扩增用器件的特征在于，按照使所述第1微珠不位于从所述平面状的面看时的所述第1空间和所述第2空间不重叠的区域的方式来配置所述第1空间和所述第2空间。2. 根据权利要求1记载的核酸扩增用器件，其中，所述第2空间不保持 所述第1孩t珠以外的微珠。3. 根据权利要求2记载的核酸扩增用器件，其中，对于所述第1微珠的 直径r，满足下述1) ~3 )的条件1) 所述第1空间的高度大于1/2r且小于3/2r;2) 所述第1空间的高度和试剂保持空间的高度之和为2r以下；3) 所述第1空间的直径大于r且小于2r。4. 根据权利要求1记载的核酸扩增用器件，其中，所述第1空间和所述 第2空间用细管连接，所述细管具有比所述第1微珠的直径小的直径。5. 根据权利要求1~4中任一项记载的核酸扩增用器件，其中，所述反应 池被流通池化。6. 根...
【专利技术属性】
技术研发人员：梶山智晴，白井正敬，神原秀记，
申请(专利权)人：株式会社日立制作所，
类型：发明
国别省市：JP
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