【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因检测，具体涉及一种基于mtdna cytb基因的苹果蠧蛾pcr检测引物及检测方法和应用。
技术介绍
1、目前用于苹果蠹蛾鉴定的方法主要有：1)形态特征鉴定。在检疫工作中，截获的往往是低龄幼虫或卵，通常的作法是对其进行室内饲养至老熟幼虫后再进行鉴定，耗时长，延长了进出口物品的通关时间，增加了检疫人员的工作强度；2)mt dna cytb基因序列变异水平高于mt dna coⅰ和mt dnacoⅱ；pcr技术等，coⅰ和coⅱ技术曾用于鉴别苹果蠹蛾及其近缘种，但是需要将pcr产物回收、纯化、测序，根据序列比对和系统发育树构建来判断检测结果，操作步骤太多，也导致耗时长。
2、综上，现有苹果蠹蛾鉴定方法存在的问题是耗时长，检测速度慢。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于mtdna cytb基因的苹果蠧蛾pcr检测引物及检测方法和应用。本专利技术的引物及pcr反应体系和反应条件，可以快速鉴别苹果蠹蛾，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且稳定性强的优点。
2、本专利技术提供一种基于mtdna cytb基因的苹果蠧蛾pcr检测引物，所述引物为cp-cytb-f和cp-cytb-r，核苷酸序列如下：
3、cp-cytb-f：
4、5’-ggttcattaattgatttaccatctccctct-3’；
5、cp-cytb-r：
6、5’-tacctaatgg
7、根据我们的引物特异性试验结果，该引物具有明确清晰的检测结果，且可以有效区分桃小食心虫、梨小食心虫与苹果蠹蛾。
8、本专利技术提供一种检测试剂盒，包括基于mtdna cytb基因的苹果蠧蛾pcr检测引物和pcr检测试剂。
9、如所述pcr检测试剂为10×easytaq buffer、high pure dntps和easytaq dnapolymerase。
10、利用上述检测试剂盒鉴定苹果蠹蛾时，无需测序，也无需根据序列比对和系统发育树构建来判断检测结果，操作步骤简化，耗时短，相比于现有技术，检测速度提升。
11、本专利技术提供一种苹果蠧蛾pcr检测方法，包括以下步骤：
12、提取待检测样本的基因组dna；
13、以提取的基因组dna为模板，利用所述的引物cp-cytb-f和cp-cytb-r进行pcr扩增；
14、扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，若扩增产物条带为586bp，则待检测样本为苹果蠹蛾，若没有586bp的条带，则待检测样本不是苹果蠹蛾。
15、优选的，pcr扩增反应体系为25μl，包括：引物cp-cytb-f、cp-cytb-r各0.5μl，基因组dna 1μl，10×easytaq buffer 2.5μl，high pure dntps 2μl，easytaq dna polymerase1μl，ddh2o补足至25μl。
16、优选的，pcr扩增的扩增反应条件为：
17、95℃预变性2min；95℃变性15s、45℃-49℃退火30s、72℃延伸45s、共40个循环；72℃延伸10min。
18、优选的，退火温度为45℃。
19、优选的，用质量分数1％的琼脂糖凝胶电泳分析，恒压110-125v，15-20min。
20、本专利技术提供一种基于mtdna cytb基因的苹果蠧蛾pcr检测引物的应用，所述引物用于鉴定苹果蠧蛾，区分苹果蠹蛾及其近缘种。
21、优选的，所述引物用于区分桃小食心虫、梨小食心虫与苹果蠹蛾。
22、优选的，所述苹果蠹蛾来自新疆阿勒泰、新疆博乐、新疆阿克陶、新疆石河子、甘肃张掖、甘肃金昌、辽宁彰武、辽宁营口、辽宁瓦房店、辽宁葫芦岛。
23、优选的，所述pcr的最低dna浓度检测限为3.125ng/μl。
24、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
25、本专利技术的pcr检测引物，利用pcr手段检测待测样本基因组dna，根据琼脂糖电泳后条带的有无及大小来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且稳定性强等优点。
26、另外，本专利技术设计的pcr引物以及建立的pcr反应体系和反应条件，能够实现快速、准确、高效对苹果蠹蛾的鉴别，可用于实际生产中对入侵害虫苹果蠹蛾的快速鉴定。可在实际中用于农业害虫和检验检疫中的害虫识别，从而为制定害虫防治策略和检疫提供参考。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种基于mtDNA Cytb基因的苹果蠧蛾PCR检测引物，其特征在于，为Cp-Cytb-F和Cp-Cytb-R，核苷酸序列如下：
2.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物和PCR检测试剂。
3.一种检测苹果蠧蛾的PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的检测苹果蠧蛾的PCR检测方法，其特征在于，PCR扩增反应体系为25μL，包括：引物Cp-Cytb-F、Cp-Cytb-R各0.5μL，基因组DNA1μL，10×EasyTaq Buffer2.5μL，High pure dNTPs 2μL，EasyTaq DNAPolymerase 1μL，ddH2O补足至25μL。
5.根据权利要求4所述的检测苹果蠧蛾的PCR检测方法，其特征在于，PCR的扩增反应条件为：
6.根据权利要求5所述的检测苹果蠧蛾的PCR检测方法，其特征在于，用质量分数1％的琼脂糖凝胶电泳分析，恒压110-125V，15-20min。
7.根据权利要求1所述的基于mtDNACytb基因的苹果蠧蛾PCR
8.根据权利要求7所述的基于mtDNA Cytb基因的苹果蠧蛾PCR检测引物的应用，其特征在于，所述引物用于区分桃小食心虫、梨小食心虫与苹果蠹蛾。
9.根据权利要求7所述的基于mtDNA Cytb基因的苹果蠧蛾PCR检测引物的应用，其特征在于，所述苹果蠹蛾来自新疆阿勒泰、新疆博乐、新疆阿克陶、新疆石河子、甘肃张掖、甘肃金昌、辽宁彰武、辽宁营口、辽宁瓦房店、辽宁葫芦岛。
10.根据权利要求7所述的基于mtDNACytb基因的苹果蠧蛾PCR检测引物的应用，其特征在于，所述PCR的最低DNA浓度检测限为3.125ng/μL。
...【技术特征摘要】
1.一种基于mtdna cytb基因的苹果蠧蛾pcr检测引物，其特征在于，为cp-cytb-f和cp-cytb-r，核苷酸序列如下：
2.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物和pcr检测试剂。
3.一种检测苹果蠧蛾的pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的检测苹果蠧蛾的pcr检测方法，其特征在于，pcr扩增反应体系为25μl，包括：引物cp-cytb-f、cp-cytb-r各0.5μl，基因组dna1μl，10×easytaq buffer2.5μl，high pure dntps 2μl，easytaq dnapolymerase 1μl，ddh2o补足至25μl。
5.根据权利要求4所述的检测苹果蠧蛾的pcr检测方法，其特征在于，pcr的扩增反应条件为：
6.根据权利要求5所述的检测苹果蠧蛾的pcr检...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。