【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于属于抗体的制备，具体涉及一种新结合表位的复合物及其筛选雌二醇-单克隆抗体复合物新表位纳米抗体的方法。
技术介绍
1、食品安全一直是公众关注的焦点。除了常见的食品安全问题，如霉菌、真菌和致病菌外，食品原材料在生产过程中的抗生素、激素、药物的滥用也会潜移默化的对身体造成损害。与致病菌不同，激素药物的滥用不会第一时间表现出来，而是随着食物链进入体内，随着时间在人体内不断积累。在畜牧业中雌二醇常作为药物应用于奶牛发情期及产奶期。尽管可以提高奶牛的产奶量，延长奶牛的产奶时间，但是会对人体尤其是青少年造成潜在的影响。免疫检测法因其操作简便、快速、特异、灵敏，而且样品前处理过程大为简化，可以满足对食品现场检测快速、简便的要求，已经成为研究的热点。免疫学方法常利用噬菌体抗体库技术制备危害食品安全的小分子半抗原的基因工程抗体的技术，但是筛选到的抗体会和小分子载体蛋白产生非特异性结合，导致抗体无法应用。
技术实现思路
1、专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种新结合表位的复合物及其筛选雌二醇-单克隆抗体复合物新表位纳米抗体的方法，有效解决了现有载体蛋白会和筛选到的抗体发生非特异性吸附的可能，从而造成筛选到的抗体并非实验所需，为小分子抗体筛选提供了一条新思路。
2、技术方案：为了实现上述目的，本专利技术所述一种用于小分子-抗体复合物新表位纳米抗体筛选的新结合表位复合物，所述复合物由e2和第一表位e2单克隆羊抗混合后，形成新结合表位复合物。
3、其
4、本专利技术所述的新结合表位的复合物在小分子-抗体复合物新表位纳米抗体的筛选中的应用。
5、其中，所述复合物作为抗原，对全合成纳米抗体文库进行富集筛选，将富集筛选后的噬菌体文库涂板，挑选单菌落进行样品制备和phage elisa实验，挑选阳性克隆进行阳性复测，蛋白表达和蛋白纯化，最终获得的纳米抗体。
6、其中，所述纳米抗体能与复合物的新表位发生特异性结合，而与e2或e2单克隆抗体不发生特异性结合。
7、进一步地，所述新结合表位复合物筛选的纳米抗体，其氨基酸序列如seq id no.1所示，碱基序列如seq id no.2所示。
8、本专利技术所述的新结合表位复合物筛选雌二醇-单克隆抗体复合物新表位纳米抗体的方法，包括如下步骤：
9、(1)合成纳米抗体文库的噬菌体侵染和纯化：
10、取全合成纳米抗体文库(全合成的大肠杆菌文库)接种至培养基中，取处于生长对数期的全合成纳米抗体文库，加入噬菌体，摇匀后，水浴反应弃上清，重悬后过夜培养，收集菌液离心取上清，加入peg8000的nacl溶液，充分混合后，放到冰上静置，离心弃清，重悬沉淀，离心吸取上清，再加入peg8000的nacl溶液再次沉淀，上下颠倒混匀直到白色悬浮液出现，然后放到冰上，离心弃上清，重悬噬菌体沉淀；然后离心至完全清除杂质，吸取上清，检测纯化获得的噬菌体的滴度；
11、(2)噬菌体文库的筛选
12、向e2羊单抗加入e2，加入到pbs中，随后将混合好的复合物作为包被抗原，加入到酶标条①中；同时将e2羊单抗加入到pbs中，加入到酶标条②中；将①和②放置在酶标板中，低温过夜，向①和②中加入bsa封闭，然后将纯化后的噬菌体文库加入到pbst中，然后加入bsa和e2羊单抗封闭；酶标条③中加入bsa封闭；将封闭好的噬菌体加入到酶标条②中预吸附，从酶标条中吸取预吸附过的噬菌体，加入到酶标条①中反应，洗涤甩干，加入甘氨酸洗脱液，室温静置，加入tris-hcl中和，蘸取少量噬菌体，用试纸条检测ph，应为中性，将液体用排枪吸取到酶标条③中反应，收集反应后的溶液，离心吸取上清，然后过滤除菌，检测筛选后的噬菌体的滴度，第二轮筛选、第三轮筛选降低羊单抗和e2的量，进行富集筛选；
13、(3)phage elisa样品制备
14、从最后一轮噬菌体文库涂板的平板上挑取单克隆菌落至yt-ai-hp培养基的孔板中，摇菌过夜，离心吸取上清，即为phage elisa待测样品；
15、(4)phage elisa
16、向e2羊单抗加入e2，用pbs将复合物稀释，将复合物作为包被抗原，加入到酶标板中，低温包被过夜，用pbst洗液洗板，拍干板子，然后加入脱脂牛奶封闭，随后加入制备好的phage elisa待测样品反应，用脱脂奶粉洗板，拍干板子，加入anti-m13 antibody(m13-hrp)反应，洗板，拍干板子，加入tmb显色液反应，再加入hcl终止液，测定吸光度值；
17、(5)phage elisa阳性复测
18、将phage elisa实验中筛选到的阳性克隆挑选出来，向e2羊单抗加入e2，用pbs将复合物稀释，随后用复合物作为包被抗原，加入到酶标板①中，将e2羊单抗加入到酶标板②中；将pbs加入到酶标板③中；低温包被过夜，用pbst洗液洗板，拍干板子，加入脱脂牛奶封闭，洗板，拍干板子，在①②③中分别加入阳性单克隆的phage上清反应，用脱脂奶粉洗板，拍干板子，加入13-hrp反应，洗板，拍干板子，加入显色液静置，加入终止液，测定吸光度值；
19、(6)噬菌体单克隆pcr扩增
20、取筛选到的阳性纳米抗体单菌落菌液进行pcr扩增结果；pcr扩增后进行电泳，位于500bp左右的条带为所需的纳米抗体；将阳性纳米抗体单菌落菌液测序，获得测序结果后进行分析，测序结果完整且为纳米抗体序列的即为筛选到的纳米抗体序列，将获得的序列送至合成公司，将纳米抗体碱基序列重组到重组质粒中，获得的重组质粒可以进行后续的表达；
21、(7)蛋白纯化
22、对纳米抗体蛋白进行洗脱纯化；
23、(8)sds-page检测
24、对纳米抗体蛋白进行sds-page检测。
25、其中，步骤(4)中实验组od值>0.6且od实验组：od对照组>2的数值为阳性克隆。
26、其中，步骤(5)中od复合物组:ode2羊单抗组之比>2且od复合物组:odpbs组之比>2的确定为真阳性样品。
27、本专利技术所述新结合表位复合物筛选雌二醇-单克隆抗体复合物新表位纳米抗体的方法筛选到的纳米抗体在制备检测试纸条中的应用。
28、本专利技术所述新结合表位复合物筛选雌二醇-单克隆抗体复合物新表位纳米抗体的方法筛选到的纳米抗体在制备检测牛奶中雌二醇含量的试纸条中的应用。
29、本专利技术将e2和第一表位e2单克隆羊抗按照特定的比例在混合后，形成新结合表位的复合物，通过噬菌体展示技术，利用复合物作为特异性抗原，用构建的全合成纳米抗体文库进行三轮亲和力筛选。将富集筛选后的噬菌体文库涂板，挑本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于小分子-抗体复合物新表位纳米抗体筛选的新结合表位复合物，其特征在于，所述复合物由E2和第一表位E2单克隆羊抗混合后，形成新结合表位复合物。
2.根据权利要求1所述的新结合表位复合物，其特征在于，所述E2和第一表位E2单克隆羊抗的摩尔比例优选为1:10-1:50。
3.一种权利要求1所述的新结合表位的复合物在小分子-抗体复合物新表位纳米抗体的筛选中的应用。
4.根据权利要求3的应用，其特征在于，所述复合物作为抗原，对全合成纳米抗体文库进行富集筛选，将富集筛选后的噬菌体文库涂板，挑选单菌落进行样品制备和Phage ELISA实验，挑选阳性克隆进行阳性复测，蛋白表达和蛋白纯化，最终获得的纳米抗体。
5.一种由权利要求1所述的新结合表位复合物筛选的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述纳米抗体能与复合物的新表位发生特异性结合，而与E2或E2单克隆抗体不发生特异性结合。
7.一种利用权利要
8.根据权利要求7所述的筛选雌二醇-单克隆抗体复合物新表位纳米抗体的方法，其特征在于，步骤(4)中实验组OD值>0.6且OD实验组：OD对照组>2的数值为阳性克隆。
9.根据权利要求7所述的筛选雌二醇-单克隆抗体复合物新表位纳米抗体的方法，其特征在于，步骤(5)中OD复合物组:ODE2羊单抗组之比>2且OD复合物组:ODPBS组之比>2的确定为真阳性样品。
10.一种新结合表位复合物筛选雌二醇-单克隆抗体复合物新表位纳米抗体的方法筛选到的纳米抗体在制备检测牛奶中雌二醇含量的试纸条中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于小分子-抗体复合物新表位纳米抗体筛选的新结合表位复合物，其特征在于，所述复合物由e2和第一表位e2单克隆羊抗混合后，形成新结合表位复合物。
2.根据权利要求1所述的新结合表位复合物，其特征在于，所述e2和第一表位e2单克隆羊抗的摩尔比例优选为1:10-1:50。
3.一种权利要求1所述的新结合表位的复合物在小分子-抗体复合物新表位纳米抗体的筛选中的应用。
4.根据权利要求3的应用，其特征在于，所述复合物作为抗原，对全合成纳米抗体文库进行富集筛选，将富集筛选后的噬菌体文库涂板，挑选单菌落进行样品制备和phage elisa实验，挑选阳性克隆进行阳性复测，蛋白表达和蛋白纯化，最终获得的纳米抗体。
5.一种由权利要求1所述的新结合表位复合物筛选的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no.1所示，碱基序列如seq id no.2所示。
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。