【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
0、专利技术背景
1、本申请要求于2021年9月30日提交的美国临时专利申请no.63/250,790、于2022年3月21日提交的美国临时专利申请no.63/322,050、和于2022年9月9日提交的美国临时专利申请no.63/405,331的优先权，其全部在此均通过引用整体并入。
2、序列表
3、本申请包含按照st.26格式准备的序列表，并在此将其通过引用整体并入。
4、创建于2022年9月23日的所述序列表命名为uclap0134wo_seq_listing，并且大小为14,520字节。
5、i.
6、本专利技术涉及癌症生物学和细胞治疗的方法的领域。
7、ii.
技术介绍
8、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)是将t细胞的特异性重定向至预定抗原的人工分子。这些受体频繁用于将单克隆抗体的特异性接枝到t细胞上；通过逆转录病毒或慢病毒载体促进其编码序列的转移。使用过继性转移，可对自体t细胞离体进行遗传修饰以表达对目的癌细胞具有特异性的car。然后将可识别并杀伤癌细胞的t细胞重新引入到患者中。该方法的i期临床研究已显示出效力。
9、最常见的car形式是来源于单克隆抗体的、与包含3个itam的cd3-ζ信号传导结构域融合的单链可变片段(single-chain variable fragment，scfv)的融合物。cd3-ζ可不提供完全有效的活化信号并且需要另外的共
10、多项临床试验报道了经抗cd19 car修饰的t细胞对急性和慢性b细胞恶性病二者的显著治疗效力。然而，也报道了多名病例复发，出现cd19阴性白血病或淋巴瘤(maude etal.2014)。需要开发解决抗原逃逸的更有效的car治疗。
技术实现思路
1、本申请通过提供用于制备显示出具有高效力的双特异性car t细胞的方法满足了需求。本公开内容的一些方面涉及用于制备cd19/cd20双特异性嵌合抗原受体(car)t细胞的方法，其包括以下中的两个、三个、四个或全部有序步骤：(a)提供包含含有t细胞的细胞群的组合物；(b)富集cd14-/cd25-/cd62l+细胞的细胞群；(c)使包含经富集细胞群的组合物与反式激活组合物、il-2和/或il-15中的一种或更多种接触；(d)用cd19/cd20双特异性car核酸转导来自(c)的细胞组合物；以及(e)从(d)的经转导细胞组合物中去除反式激活组合物。另一些方面涉及通过本公开内容的方法产生的car-t细胞群和包含该细胞群的组合物。另一些方面描述了用于治疗b细胞恶性病患者的方法，其包括施用本公开内容的细胞。另一些方面涉及用于制备cd19/cd20双特异性嵌合抗原受体(car)t细胞的方法，其包括以下中的两个、三个或全部有序步骤：(a)提供包含含有t细胞的细胞群的组合物；(b)使包含细胞群的组合物与反式激活组合物、il-2和/或il-15中的一种或更多种接触；(c)用cd19/cd20双特异性car核酸转导来自(b)的包含细胞群的组合物；(d)从(c)的经转导细胞组合物中去除反式激活组合物；并且其中反式激活组合物包含gmp t celltransacttm。另一些方面涉及用于制备cd19/cd20双特异性嵌合抗原受体(car)t细胞的方法，其包括以下中的两个、三个或全部有序步骤：(a)提供包含含有t细胞的细胞群的组合物；(b)使包含细胞群的组合物与反式激活组合物、il-2和/或il-15中的一种或更多种接触；(c)用cd19/cd20双特异性car核酸转导来自(b)的包含细胞群的组合物；(d)从(c)的经转导细胞组合物中去除反式激活组合物；并且其中所述方法还包括在细胞转导的24小时内使细胞与硫酸鱼精蛋白接触。
2、另一些方面涉及用于制备(car)t细胞的方法，其包括以下有序步骤：(a)提供包含含有t细胞的细胞群的组合物；(b)使包含细胞群的组合物与反式激活组合物、il-2和/或il-15中的一种或更多种接触；(c)用编码car的核酸转导来自(b)的包含细胞群的组合物；(d)从(c)的经转导细胞组合物中去除反式激活组合物；并且其中所述方法还包括在细胞转导的24小时内使细胞与硫酸鱼精蛋白接触。另一些方面涉及用于制备(car)t细胞的方法，其包括以下有序步骤：(a)提供包含含有t细胞的细胞群的组合物；(b)使包含细胞群的组合物与反式激活组合物、il-2和/或il-15中的一种或更多种接触；(c)用编码car的核酸转导来自(b)的包含细胞群的组合物；(d)从(c)的经转导细胞组合物中去除反式激活组合物；并且其中反式激活组合物包含gmp t cell transacttm。在一些方面中，car t细胞包含cd19/cd20双特异性car t细胞和/或者核酸编码cd19/cd20双特异性car。
3、在一些方面中，car t细胞包含tgf-β单特异性、tgf-β双特异性、tgf-β三特异性、bcma单特异性、bcma双特异性、bcma三特异性、bcma/cs1双特异性、il13ra2/tgf-β双特异性、il13rα2单特异性、il13rα2双特异性、il13rα2三特异性、gd2单特异性、gd2双特异性、gd2三特异性、egfrviii单特异性、egfrviii双特异性、egfrviii三特异性、il13rα2/gd2双特异性、il13ra2/egfrviii双特异性、gd2/egfrviii双特异性、gd2/tgf-β双特异性、tyrp1单特异性、tyrp1双特异性、tyrp1三特异性或tyrp1/tgf-β双特异性car。il13rα2car可包含il13多肽。car可包含对癌症抗原具有特异性的scfv。在一些方面中，包含il13rα2结合区的car包含il13多肽，例如il13突变蛋白。
4、另一些方面涉及用于制备cd19/cd20双特异性嵌合抗原受体(car)t细胞的方法，其包括以下中的两个、三个或全部有序步骤：(a)提供包含含有t细胞的细胞群的组合物；(b)使包含细胞群的组合物与一种或更多种反式激活组合物、il-2和il-15接触；(c)用cd19/cd20双特异性car核酸转导来自(b)的包含细胞群的组合物；(d)从(c)的经转导细胞组合物中去除反式激活组合物；其中反式激活组合物包含gmp t celltransacttm；并且其中il-2的浓度为50iu/ml和/或il-15的浓度为0.5ng/ml。另一方面涉及用于制备cd19/cd20双特异性嵌合抗原受体(car)t细胞的方法，其包括以下中的两个、三个或全部有序步骤：(a)提供包含含有t细胞的细胞群的组合物；(b)使包含细胞群的组合物与反式激活组合物、il-2和/或il-15中的一种本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于制备CD19/CD20双特异性嵌合抗原受体(CAR)T细胞的方法，其包括以下有序步骤：
2.用于制备CD19/CD20双特异性嵌合抗原受体(CAR)T细胞的方法，其包括以下有序步骤：
3.权利要求1或2所述的方法，其中来自(a)、(b)、(c)和/或(d)的包含所述细胞群的组合物包含细胞培养基，其中所述细胞培养基是无血清的。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述含有T细胞的细胞群的CD14+或CD25+细胞未被耗竭。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述方法包括使所述组合物与反式激活组合物接触，并且其中所述反式激活组合物包含GMP T cell TransActTM。
6.权利要求5所述的方法，其中所述反式激活组合物以1:25至1:40的效价使用。
7.权利要求5或6所述的方法，其中将所述反式激活组合物稀释至1:35。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中(a)中的细胞群包含通过白细胞去除术从患者中分离的细胞。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中在所述细胞与所述反式激活组合物第一次接触之后6至7天去除所述反式激活组合物。
11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中用包含编码所述CAR的核酸的基于慢病毒的病毒转导所述细胞。
12.权利要求11所述的方法，其中所述病毒被包装在HEK-293T细胞中。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述细胞转导的24小时内使所述细胞与硫酸鱼精蛋白接触。
14.权利要求13所述的方法，其中硫酸鱼精蛋白的终浓度为10至20μg/mL。
15.权利要求13或14所述的方法，其中在包含硫酸鱼精蛋白、IL-2、IL-15和包含编码所述CAR的核酸的病毒的组合物中转导所述细胞。
16.权利要求15所述的方法，其中所述核酸包含慢病毒载体骨架。
17.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述核酸编码具有抗CD19/CD20结合区的CAR多肽，并且其中所述抗CD19/CD20结合区包含SEQ ID NO:3。
18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述核酸编码包含以下的CAR多肽：IgG4铰链区、CD28跨膜区、4-1BB共刺激区和CD3-ζ胞内信号传导结构域。
19.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述核酸编码具有SEQ ID NO:1的序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的序列的CAR多肽。
20.权利要求11至15中任一项所述的方法，其中所述病毒的MOI为0.1至1.5。
21.权利要求1至20中任一项所述的方法，其中将所述细胞以1×106个细胞/mL的浓度转导。
22.权利要求1至21中任一项所述的方法，其中将至少1％的细胞转导。
23.权利要求1至22中任一项所述的方法，其中在转导之后3天时，至少30％的细胞是有生存力的。
24.权利要求11至21中任一项所述的方法，其中将所述细胞与病毒、硫酸鱼精蛋白、IL-2和IL-15一起孵育6至12小时。
25.权利要求1至24中任一项所述的方法，其中在转导之后，将所述细胞扩增1.5至25倍。
26.权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述方法不包括在步骤(c)之后进行富集或耗竭。
27.权利要求1至26中任一项所述的方法，其中截止步骤(a)之后14天，细胞数量为至少1×108至5×109个细胞。
28.权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将所述细胞冷冻保存。
29.权利要求28所述的方法，其中在临冷冻保存前，细胞数量为至少1×108至5×109个细胞。
30.权利要求29所述的方法，其中将所述细胞以1×106个细胞/mL至15×106个细胞/mL的浓度冷冻保存。
31.权利要求28至28中任一项所述的方法，其中在转导之后少于17天将所述细胞冷冻保存。
32.权利要求28至31中任一项所述的方法，其中在冷冻保存之前，对所述细胞进行过滤。
33.CAR-T细胞群，其通过权利要求1至32中任一项所述的方法产生。
34.权利要求33所述的细胞群，其中所述细胞是解冻的。
<...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.用于制备cd19/cd20双特异性嵌合抗原受体(car)t细胞的方法，其包括以下有序步骤：
2.用于制备cd19/cd20双特异性嵌合抗原受体(car)t细胞的方法，其包括以下有序步骤：
3.权利要求1或2所述的方法，其中来自(a)、(b)、(c)和/或(d)的包含所述细胞群的组合物包含细胞培养基，其中所述细胞培养基是无血清的。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述含有t细胞的细胞群的cd14+或cd25+细胞未被耗竭。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述方法包括使所述组合物与反式激活组合物接触，并且其中所述反式激活组合物包含gmp t cell transacttm。
6.权利要求5所述的方法，其中所述反式激活组合物以1:25至1:40的效价使用。
7.权利要求5或6所述的方法，其中将所述反式激活组合物稀释至1:35。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中(a)中的细胞群包含通过白细胞去除术从患者中分离的细胞。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在使包含所述细胞群的组合物与反式激活组合物、il-2和/或il-15中的一种或更多种接触之后24至72小时进行所述细胞转导。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中在所述细胞与所述反式激活组合物第一次接触之后6至7天去除所述反式激活组合物。
11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中用包含编码所述car的核酸的基于慢病毒的病毒转导所述细胞。
12.权利要求11所述的方法，其中所述病毒被包装在hek-293t细胞中。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述细胞转导的24小时内使所述细胞与硫酸鱼精蛋白接触。
14.权利要求13所述的方法，其中硫酸鱼精蛋白的终浓度为10至20μg/ml。
15.权利要求13或14所述的方法，其中在包含硫酸鱼精蛋白、il-2、il-15和包含编码所述car的核酸的病毒的组合物中转导所述细胞。
16.权利要求15所述的方法，其中所述核酸包含慢病毒载体骨架。
17.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述核酸编码具有抗cd19/cd20结合区的car多肽，并且其中所述抗cd19/cd20结合区包含seq id no:3。
18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述核酸编码包含以下的car多肽：igg4铰链区、cd28跨膜区、4-1bb共刺激区和cd3-ζ胞内信号传导结构域。
19.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述核酸编码具有seq id no:1的序列或与seq id no:1具有至少80％序列同一性的序列的car多肽。
20.权利要求11至15中任一项所述的方法，其中所述病毒的moi为0.1至1.5。
21.权利要求1至20中任一项所述的方法，其中将所述细胞以1×106个细胞/ml的浓度转导。
22.权利要求1至21中任一项所述的方法，其中将至少1％的细胞转导。
23.权利要求1至22中任一项所述的方法，其中在转导之后3天时，至少30％的细胞是有生存力的。
24.权利要求11至21中任一项所述的方法，其中将所述细胞与病毒、硫酸鱼精蛋白、il-2和il-15一起孵育6至12小时。
25.权利要求1至24中任一项所述的方法，其中在转导之后，将所述细胞扩增1.5至25倍。
26.权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述方法不包括在步骤(c)之后进行富集或耗竭。
27.权利要求1至26中任一项所述的方法，其中截止步骤(a)之后14天，细胞数量为至少1×108至5×109个细胞。
28.权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将所述细胞冷冻保存。
29.权利要求28所述的方法，其中在临冷冻保存前，细胞数量为至少1×108至5×109个细胞。
30.权利要求29所述的方法，其中将所述细胞以1×106个细胞/ml至15×106个细胞/ml的浓度冷冻保存。
31.权利要求28至28中任一项所述的方法，其中在转导之后少于17天将所述细胞冷冻保存。
32.权利要求28至31中任一项所述的方法，其中在冷冻保存之前，对所述细胞进行过滤。
33.car-t细胞群，其通过权利要求1至32中任一项所述的方法产生。
34.权利要求33所述的细胞群，其中所述细胞是解冻的。
35.权利要求33或34所述的细胞群，其中该群包含至少5％的cd62l+car-t+细胞。
36.权利要求33至35中任一项所述的细胞群，其中所述细胞包含至少15％的cd3+细胞。
37.权利要求33至36中任一项所述的细胞群，其中所述细胞中的每个经转导细胞具有平均1至3个拷贝的编码所述car的核酸。
38.权利要求34至37中任一项所...
【专利技术属性】
技术研发人员：伊冯娜·于轩·陈，克里斯托弗·M·瓦尔特斯，贝亚塔·贝伦特毛兹，莫比纳·罗尚德尔，布伦达·吉，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：
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