【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种木聚糖酶的热稳定性突变体及理性设计方法，属于酶工程领域。
技术介绍
1、木质纤维素是自然界中最丰富的可再生生物质。它由纤维素(35-50％)，半纤维素(20-30％)和木质素(20-30％)组成。木聚糖酶(ec 3.2.1.8)水解半纤维素中的木聚糖主链，在食品、饲料、造纸、植物营养等方面有广泛的应用。在造纸和纸浆工业中，需要大量有害的含氯化学品进行漂白。在高温(80～85℃)和碱性条件(ph>10)下使用木聚糖酶可以同时降解半纤维素并释放木质素，提高纤维素的含量。这增强了漂白效果，并减少了大约10％-15％的含氯化学品的使用。然而，大多数天然木聚糖酶在这样的条件下具有较差的活性和热稳定性。嗜热拟青霉木聚糖酶被发现在碱性条件下具有较高的活性，其最佳反应温度为65℃。这说明它在造纸和纸浆工业中有应用潜力。通过在c端引入二硫键，它(xynm2)的最适温度提高到75℃。然而，在温度超过80℃时，它的活性大幅度降低。为了解决这一问题，需要对木聚糖酶进行改造，提高木聚糖酶在高温碱性条件下的活性及热稳定性。
2、定向进化和理性设计是蛋白质工程的两种主要策略。前一种策略依赖于高质量的随机突变文库的构建和高通量筛选方法，需要很大的工作量和高性能设备来迭代积累有益的突变。理性设计包括使用计算工具在原子水平上分析蛋白质的结构和功能，例如3d结构预测，计算折叠自由能变化(δδgfold)，多序列比对(msa)和分子动力学(md)模拟。突变稳定性的改变会影响δgfold,：δgfold降低表示突变稳定性的增加，而δg
3、但是，δδgfold只反映酶的稳定性，而不反映活性。由于稳定性和活性之间潜在的权衡关系，一些突变在提高稳定性的同时可能会对酶的活性产生不利影响。因此如何制备高温碱性条件下活性及热稳定性都很优异的木聚糖酶突变体，是我们面临的问题。
技术实现思路
1、为了解决木聚糖酶在高温碱性下不稳定、酶活低的问题，本专利技术提供提供一种新型木聚糖酶突变体及理性设计方法。
2、本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是：
3、一方面，本专利技术提供一种热稳定性提高的木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体包含与seq id no:1所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，且包含下组中至少一个氨基酸的取代：s19t，e31p，g40s，d41g，a57n，e109y，d135n,h170m。
4、另一方面，本专利技术所述的木聚糖酶突变体，其氨基酸序列如seq id no:3或seq idno:4或seq id no:5或seq id no:6或seq id no:7或seq id no:8或seq id no:9或seq idno:10或seq id no:11或seq id no:12或seq id no:13或seq id no:14或seq id no:15所示。
5、另一方面，本专利技术涉及一种编码上述木聚糖酶突变体的基因。
6、另一方面，本专利技术涉及一种携带上述木聚糖酶突变体基因的重组载体。
7、另一方面，本专利技术涉及一种包含前述基因、或前文所述重组载体转化的重组菌。
8、在具体的实施方案中，所述菌为大肠杆菌。
9、在更具体的实施方案中，所述大肠杆菌为大肠杆菌top(10)或大肠杆菌bl21(de3)。
10、另一方面，本专利技术涉及前文所述的木聚糖酶突变体的制备方法包括：将前文任一项所述木聚糖酶突变体的基因插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体转化工程菌，获得重组工程菌，进行酶的异源表达和分离纯化，得到木聚糖酶突变体。
11、在具体的实施方案中，所述表达载体为pet-28a(+)。
12、另一方面，本专利技术涉及前文任一项所述的木聚糖酶突变体、前文所述的基因、前文所述的重组载体、或前文所述的重组工程菌在降低木质纤维素中的半纤维素和木质素，提高纤维素含量中的应用。
13、另一方面，本专利技术涉及一种提高木聚糖酶热稳定性的理性设计方法，综合了解折叠自由能计算及序列保守性分析，具体步骤为：
14、1)在野生型酶蛋白中，每个氨基酸残基分别被其他19个氨基酸取代，并使用三个计算工具rosetta cartesian_ddg，rosetta ddg_monomer和foldx预测这些突变体的解折叠自由能(δgfold)。为了量化这些突变引起的稳定性改变，每个突变体与野生型酶之间的解折叠自由能变化(δδgfold)的由下式计算:
15、
16、2)多序列比对由hot spot wizard online server内置的程序sequenceconsensus构建，选取与目标序列相似度为30-90％的1800条序列，聚类成200条序列，分析各残基位置的出现频率，序列同源性由blast和useaech识别，并由clustal omega工具比对；
17、3)通过不同的筛选标准，选择可能的热稳定性突变，构建单点突变体，在大肠杆菌中表达蛋白后，经过镍亲和层析柱纯化，测量突变体的δtm以及在80℃下反应1h的相对酶活力，评估点突变对木聚糖酶活性的影响；
18、4)选取热稳定性和活性均提高的单点突变体，通过rosetta cartesian_ddg，进行虚拟组合并计算出解折叠自由能变化，多变体中解折叠自由能变化降低最多的组合突变体即为设计的最优组合突变体；最后，表征突变体的酶学性质，验证该热稳定性木聚糖酶突变体是否可以在极端条件下减少木质纤维素中半纤维素和木质素，从而提高纤维素的含量；
19、在具体的实施方案中，所述野生型蛋白为氨基酸序列seq id no:1所示的木聚糖酶蛋白。
20、根据自然进化的观点，对蛋白质折叠和酶活性至关重要的氨基酸残基具有更高的保守性。因此，我们通过多序列比对(msa)来计算所有位置不同氨基酸出现的频率来判定其保守性。然后，同时结合解折叠自由能变化和保守性分析两种方法来设计在活性和稳定性均提高的有益突变。最后再通过理性组合，获得优异的多突变酶，大幅度提高热稳定性和活性。
21、本专利技术的有益效果是：
22、(1)本专利技术提出一种高效的通过理性设计增强木聚糖酶热稳定性和催化效率的方法。此方法权衡突变体解折叠自由能变化以及氨基酸保守性来设计突变体。这种方法可以为其他热稳定性酶的设计提供方法指导。
23、(2)我们提供了热稳定性和活性同时增强的多点突变体xynm9本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体包含与SEQ ID NO:1所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：19、31、40、41、57、109、135、170。
2.如权利要求1所述的木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：S19T，E31P，G40S，D41G，A57N，E109Y，D135N，H170M。
3.如权利要求2所述的木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15所示。
4.编码权利要求1-3任一项所述木聚糖酶突变体的基因。
5.包含权利要求4所述基因的重组载体。
6.含有权利
7.权利要求1-3任一项所述的木聚糖酶突变体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将编码权利要求1-3任一项所述木聚糖酶突变体的基因插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体转化工程菌，获得重组工程菌，再进行酶的异源表达和分离纯化，得到木聚糖酶突变体；
8.权利要求1-3任一项所述的木聚糖酶突变体、权利要求4所述的基因、权利要求5所述的重组载体、或权利要求6所述的重组工程菌在降低木质纤维素中的半纤维素和木质素，提高纤维素含量中的应用。
9.一种提高木聚糖酶热稳定性的理性设计方法，其特征在于，所述方法综合了突变体吉布斯自由能计算及序列保守性分析，具体步骤为：
10.如权利要求9所述的提高木聚糖酶热稳定性的理性设计方法，其特征在于，所述野生型木聚糖酶蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的木聚糖酶蛋白。
...【技术特征摘要】
1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体包含与seq id no:1所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，且与seq id no:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：19、31、40、41、57、109、135、170。
2.如权利要求1所述的木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：s19t，e31p，g40s，d41g，a57n，e109y，d135n，h170m。
3.如权利要求2所述的木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如seqid no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq idno:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14或seq idno:15所示。
4.编码权利要求1-3任一项所述木聚糖酶突变体...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。