【技术实现步骤摘要】
本专利技术专利涉及细胞工程领域，具体涉及一种适用于细胞爬片的hek-293细胞株及其构建方法和应用。
技术介绍
1、细胞爬片是将厚度约为0.17mm、玻璃材质的盖玻片浸泡在细胞培养基中，细胞在玻片上生长，细胞爬片主要应用于高质量的细胞免疫荧光和原位杂交等制作。此外，在测试细胞免疫荧光和原位杂交实验时，玻璃爬片可接受多种化学试剂的暴露处理，应用范围较塑料爬片广泛。人胚肾293(hek-293)细胞由于具有较高的生长特性和转染效率，是外源基因表达和药物功能研究常用的细胞系，是细胞爬片经常使用的细胞之一。但是，专利技术人发现，hek-293在盖玻上生长速度慢、贴壁效果差，造成细胞脱片，影响细胞爬片的制作及后期应用。
2、细胞的爬片效果取决于细胞与玻片的粘附能力，决定细胞粘附能力的关键因子是整合素(integrin)及其受体的结合。整合素由一个alpha(α)和一个beta(β)亚基组成异二聚体，目前已知共发现18个α亚基变体和8个β亚基变体，产生24个异二聚体。目前研究显示α5、β3和β5的表达对细胞粘附至关重要，但这些亚基在hek-293的表达水平相对较低，这是其低粘附能力的原因之一。此外，由于玻璃材质的盖玻片缺少整合素基质，进一步影响hek-293细胞的粘附能力，降低爬片效果的降低。
3、开发一种可以高表达整合素α5和/或β3和/或β5的hek-293细胞株是有必要的。
技术实现思路
1、本专利技术开发了一种可以提高细胞爬片效果的hek-293细胞株的构建方法
2、为了达到上述目的，本专利技术可以采用以下技术方案：
3、本专利技术一方面提供一种适用于细胞爬片的hek-293细胞株的构建方法，其包括：将整合素基因通过基因转染的方式整合至hek-293细胞株中得适用于细胞爬片的hek-293细胞株，整合素基因为以下基因中一种或多种基因组合：编码整合素α5的基因、编码整合素β3的基因、编码整合素β5的基因。
4、具体地，整合素α5的氨基酸序列如seq id no:1所示，整合素β3的氨基酸序列如seq id no:2所示，整合素β5的氨基酸序列如seq id no:3所示。
5、需要说明的是，本专利技术可以将编码整合素α5的基因、编码整合素β3的基因、编码整合素β5的基因中的一种或多种转染至hek-293细胞株中获得高表达整合素α5、整合素β3或整合素β5的hek-293细胞株。
6、优选地，上述整合素基因为以下基因中的一种：编码整合素α5的基因、编码整合素α5的基因和编码整合素β3的基因组合、编码整合素α5的基因和编码整合素β5的基因组合。
7、具体地，编码整合素α5的基因的序列如seq id no:4所示，编码整合素β3的基因的序列如seq id no:5所示，编码整合素β5的基因的序列如seq id no:6所示。
8、需要说明的是，上述构建方法中，可以优选上述组合进行转染；另外，编码整合素α5的基因和编码整合素β3的基因组合与编码整合素α5的基因和编码整合素β5的基因组合基因转染得到的hek-293细胞株的贴璧效果优于仅转染编码整合素α5的基因构建得到的hek-293细胞株。
9、优选地，上述构建方法包括：将整合素基因通过基因转染的方式整合至初级hek-293细胞株中得适用于细胞爬片的hek-293细胞株。
10、需要说明的是，本专利技术中优选分化较少的hek-293细胞株进行转染，所以本专利技术中可以优选初级hek-293细胞株进行转染。
11、优选地，上述构建方法包括：(1)使用胰酶将hek-293细胞株进行消化传代，然后使用高糖dmem(dulbecco’s modified eagle medium,gibco,货号11965092)，10％胎牛血清(gibco,货号10099158)和青霉素-链霉素(gibco，货号15140148)培养；(2)将整合素基因克隆至表达载体上得重组过表达载体；(3)用限制性内切酶pvu i将重组过表达载体的氨苄抗性位点酶切，使重组过表达载体线性化得线性化重组过表达载体；(4)线性化重组过表达载体转染至hek-293细胞株中；(5)转染后，使用含新霉素抗性基因筛选出稳转hek-293细胞株，即适用于细胞爬片的hek-293细胞株。
12、需要说明的是，在转染的过程中，只有当hek-293细胞基因组dna发生断裂时，质粒才有机会整合至宿主染色体dna中，但鉴于质粒的环形结构，这种整合插入是随机的，导致整合效率低，并且有可能破坏目的基因的表达，通常的目的细胞的获得远远低于十万分之一个细胞。为解决这一问题，本专利技术中在质粒转化之前，用限制性内切酶pvu i(takara,货号1242b)将质粒的氨苄抗性位点酶切，使质粒线性化，线性化质粒转染时，不但可提高基因组染色体的整合效率(约万分之一个细胞)，同时可保障目的基因的正确表达；从而显著提高目的基因过表达细胞的筛选与获得。
13、优选地，上述构建方法的步骤(2)中，表达载体可以包括pcdna3.1(+)、pcmv或penter，更优选为pcdna3.1(+)。
14、需要说明的是，本专利技术中，表达载体可以为本专利技术中常用的表达载体，比如pcdna3.1(+)、pcmv或penter，其中，pcdna3.1可用于多种哺乳动物细胞的外源基因高水平表达、组成性表达，所以更优选优选pcdna3.1(+)。
15、优选地，上述构建方法的步骤(2)中，对表达载体进行bamhi和xhoi双酶切，并将整合素基因克隆至双酶切位点得重组表达载体。
16、优选地，上述构建方法的步骤(5)中，新霉素的浓度为100μg/ml-4000μg/ml，更优选600μg/ml-1800μg/ml。具体地，筛选过程如下：(1)将转染后48小时的hek-293细胞胰酶消化传代至新的t25或t75培养瓶中，细胞密度(汇合度)不超过20％；(2)在培养基中添加100μg/ml-4000μg/ml新霉素(g418硫酸盐)(gibco，货号10131035)，更优选600μg/ml-1800μg/ml；(3)每隔3-4天更换含有新霉素的筛选培养基；(4)筛选7天后，观察并评估细胞集落(克隆)的形成情况，如有需要可以将筛选延长至44-20天；(5)挑取并转移5-10格克隆至新的培养皿、培养板中，继续用喊药物的筛选培养基维持培养7-10天。
17、优选地，上述构建方法的步骤(4)中，筛选时间可以为2-8周。
18、优选地，上述构建方法的转染使用的转染试剂为lipo 3000,pei试剂，更优选为25kda pei试剂。
19、优选地，上述构建方法的重组表达载体的转染浓度为500μg/ml-4000μg/ml，比如700μg/ml、1000μg/ml、1500μg/ml、2000μg/ml、2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种适用于细胞爬片的HEK-293细胞株的构建方法，其特征在于，包括：将整合素基因通过基因转染的方式整合至HEK-293细胞株中得适用于细胞爬片的HEK-293细胞株，整合素基因为以下基因中一种或多种基因组合：编码整合素α5的基因、编码整合素β3的基因、编码整合素β5的基因。
2.根据权利要求1所述的适用于细胞爬片的HEK-293细胞株的构建方法，其特征在于，整合素基因为以下基因中的一种：编码整合素α5的基因、编码整合素α5的基因和编码整合素β3的基因组合、编码整合素α5的基因和编码整合素β5的基因组合。
3.根据权利要求1或2所述的适用于细胞爬片的HEK-293细胞株的构建方法，其特征在于，包括：将整合素基因通过基因转染的方式整合至初级HEK-293细胞株中得适用于细胞爬片的HEK-293细胞株。
4.根据权利要求3所述的适用于细胞爬片的HEK-293细胞株的构建方法，其特征在于，包括：(1)使用胰酶将HEK-293细胞株进行消化传代，然后使用高糖DMEM，10％血清和青链霉素培养；(2)将整合素基因克隆至表达载体上得重组过表达载体；(3
5.根据权利要求4所述的适用于细胞爬片的HEK-293细胞株的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，表达载体选自pcDNA3.1(+)、pCMV或pENTER。
6.根据权利要求3至5中任一项权利要求所述的适用于细胞爬片的HEK-293细胞株的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，对表达载体进行BamhI和XhoI双酶切，并将整合素基因克隆至双酶切位点得重组表达载体。
7.根据权利要求3至5中任一项权利要求所述的适用于细胞爬片的HEK-293细胞株的构建方法，其特征在于，步骤(5)中，新霉素的浓度为100μg/mL-4000μg/mL，优选600μg/mL-1800μg/mL。
8.根据权利要求3至5中任一项权利要求的适用于细胞爬片的HEK-293细胞株的构建方法，其特征在于，转染使用的转染试剂为lipo 3000,PEI试剂，优选25kDa PEI试剂；和/或重组表达载体的转染浓度为500μg/mL-4000μg/mL。
9.权利要求3至8中任一项权利要求所述的适用于细胞爬片的HEK-293细胞株的构建方法构建得到的HEK-293细胞株。
10.权利要求9所述的HEK-293细胞株在细胞免疫荧光或原位杂交中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种适用于细胞爬片的hek-293细胞株的构建方法，其特征在于，包括：将整合素基因通过基因转染的方式整合至hek-293细胞株中得适用于细胞爬片的hek-293细胞株，整合素基因为以下基因中一种或多种基因组合：编码整合素α5的基因、编码整合素β3的基因、编码整合素β5的基因。
2.根据权利要求1所述的适用于细胞爬片的hek-293细胞株的构建方法，其特征在于，整合素基因为以下基因中的一种：编码整合素α5的基因、编码整合素α5的基因和编码整合素β3的基因组合、编码整合素α5的基因和编码整合素β5的基因组合。
3.根据权利要求1或2所述的适用于细胞爬片的hek-293细胞株的构建方法，其特征在于，包括：将整合素基因通过基因转染的方式整合至初级hek-293细胞株中得适用于细胞爬片的hek-293细胞株。
4.根据权利要求3所述的适用于细胞爬片的hek-293细胞株的构建方法，其特征在于，包括：(1)使用胰酶将hek-293细胞株进行消化传代，然后使用高糖dmem，10％血清和青链霉素培养；(2)将整合素基因克隆至表达载体上得重组过表达载体；(3)用限制性内切酶pvu i将重组过表达载体的氨苄抗性位点酶切，使重组过表达载体线性化得线性化重组过表达载体；(4)线性化重组过表达载体转染至hek-293细胞株中；(5)转染后，使用含新霉素...
【专利技术属性】
技术研发人员：金立方，陈萍，傅国权，
申请(专利权)人：绍兴金易生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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