【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，具体涉及一种薏苡遗传转化方法。
技术介绍
1、薏苡(coix lacryma-jobi l.)又名薏仁米，是特色的药食同源杂粮。遗传转化技术是生物育种的基础，可用于作物品种的快速、精准改良或驯化，然而，目前尚未有薏苡遗传转化技术的相关报道。因此，开发薏苡遗传转化技术，将促进薏苡从传统育种向生物育种转变。
2、现有薏苡遗传转化方法为使用含有外源基因的农杆菌直接侵染离体幼芽，这种方法未经过脱分化和再分化过程，转化多为嵌合体，阳性率较低。此外，不同物种、不同品系所适用的遗传转化侵染条件并不相同，目前，针对小白壳薏苡愈伤组织转化侵染的方法并未见报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种薏苡遗传转化方法。
2、为了达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：
3、提供一种薏苡遗传转化方法，其包括以下步骤：
4、步骤1、选择成熟健康的小白壳薏苡种仁，灭菌培养，切下幼芽，将幼芽培养诱导出胚性愈伤组织；
5、步骤2、选择含有以玉米泛素启动子ubi驱动绿色荧光蛋白gfp表达的质粒pext06，以卡那霉素抗性基因nptⅱ作为原核筛选标记，以潮霉素磷酸转移酶基因hpt作为真核筛选标记，将该质粒通过热激法转化入eha105农杆菌感受态细胞，涂布于yep平板，培养；
6、步骤3、将颜色黄嫩、颗粒感明显的胚性愈伤组织挑于无菌组培瓶内，倒入准备好的农杆菌菌液，晃动瓶身使两者充分接触；侵染，使农杆菌侵
7、步骤4、将共培养后的愈伤组织转置于ms筛选培养基中，筛选后，非抗性愈伤组织死亡，将抗性愈伤转移至ms分化培养基中，光照培养，抗性愈伤组织再生出幼芽；培养，幼芽生根成活。
8、进一步地，步骤1的方法具体为：选择成熟健康的小白壳薏苡种仁，用自来水洗去表面的灰尘杂质，将其浸泡于10％次氯酸钠溶液中，在200rpm摇床摇动灭菌10min后倒掉废液并用超纯水洗去残留，接着加入75％酒精，同于摇床摇动灭菌，2min后洗净残留；将灭菌后的种仁浸泡于1％双氧水，在30℃的培养箱中放置3d，3d后幼芽长至0.5cm，在超净台中切下幼芽，将其培养在添加5mg/l 2,4-d和0.15mg/l 6-ba的ms培养基中，在25℃的暗培养条件下生长60d后，诱导出大量的胚性愈伤组织。
9、进一步地，步骤2中，培养的具体方法为：在28℃的培养箱中倒置培养2～3d后，挑取单菌落至1ml相同浓度抗生素的yep液体培养基中，200rpm 28℃摇床过夜培养，菌液浑浊后，对菌液进行pcr扩增及电泳检测，确保质粒正确转入菌体。
10、进一步地，步骤3中，还包括，向抗性培养基中加入农杆菌菌液，于200rpm28℃摇床过夜培养至od600为0.6～0.8后，将菌液倒入离心管，6000rpm离心10min对菌体进行收集，之后倒掉管内液体，用侵染液重悬菌体至od600为0.35备用。
11、进一步地，侵染的具体方法为：将菌液与愈伤组织的组培瓶按照抽真空10min、超声10min、抽真空10min的侵染方式依次进行处理，使农杆菌侵染进入愈伤组织细胞。
12、进一步地，步骤6的方法具体为：将共培养后的愈伤组织转置于以30mg/l潮霉素为真核筛选压力，以200mg/l特美汀为农杆菌生长抑制剂，添加3mg/l2,4-d和0.15mg/l 6-ba的ms筛选培养基中，筛选30d后，非抗性愈伤组织死亡，将抗性愈伤转移至含有2mg/l 6-ba、2mg/l kt、5mg/l潮霉素、200mg/l特美汀的ms分化培养基中，于25℃的光照培养箱中光照培养60d后，潮霉素抗性愈伤组织再生出幼芽；待幼芽长至2.5cm，将其转移至添加了0.5mg/liba、5mg/l潮霉素、200mg/l特美汀的1/2ms培养基中，培养7天后，幼芽生根成活。
13、本专利技术的有益效果为：
14、本专利技术涉及一种将外源基因遗传转化进入薏苡体内的方法，该方法可成功将外源的绿色荧光蛋白基因转化进入薏苡体内，可用于未来薏苡的生物育种。
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1.一种薏苡遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的薏苡遗传转化方法，其特征在于，步骤1的方法具体为：选择成熟健康的小白壳薏苡种仁，用自来水洗去表面的灰尘杂质，将其浸泡于10％次氯酸钠溶液中，在200rpm摇床摇动灭菌10min后倒掉废液并用超纯水洗去残留，接着加入75％酒精，同于摇床摇动灭菌，2min后洗净残留；将灭菌后的种仁浸泡于1％双氧水，在30℃的培养箱中放置3d，3d后幼芽长至0.5cm，在超净台中切下幼芽，将其培养在添加5mg/L 2,4-D和0.15mg/L 6-BA的MS培养基中，在25℃的暗培养条件下生长60d后，诱导出大量的胚性愈伤组织。
3.根据权利要求1所述的薏苡遗传转化方法，其特征在于，步骤2中，培养的具体方法为：在28℃的培养箱中倒置培养2～3d后，挑取单菌落至1mL相同浓度抗生素的YEP液体培养基中，200rpm 28℃摇床过夜培养，菌液浑浊后，对菌液进行PCR扩增及电泳检测，确保质粒正确转入菌体。
4.根据权利要求1所述的薏苡遗传转化方法，其特征在于，步骤3中，还包括，向抗性培养基中加入
5.根据权利要求4所述的薏苡遗传转化方法，其特征在于，侵染的具体方法为：将菌液与愈伤组织的组培瓶按照抽真空10min、超声10min、抽真空10min的侵染方式依次进行处理，使农杆菌侵染进入愈伤组织细胞。
6.根据权利要求1所述的薏苡遗传转化方法，其特征在于，步骤6的方法具体为：将共培养后的愈伤组织转置于以30mg/L潮霉素为真核筛选压力，以200mg/L特美汀为农杆菌生长抑制剂，添加3mg/L 2,4-D和0.15mg/L 6-BA的MS筛选培养基中，筛选30d后，非抗性愈伤组织死亡，将抗性愈伤转移至含有2mg/L 6-BA、2mg/L KT、5mg/L潮霉素、200mg/L特美汀的MS分化培养基中，于25℃的光照培养箱中光照培养60d后，潮霉素抗性愈伤组织再生出幼芽；待幼芽长至2.5cm，将其转移至添加了0.5mg/L IBA、5mg/L潮霉素、200mg/L特美汀的1/2MS培养基中，培养7天后，幼芽生根成活。
...【技术特征摘要】
1.一种薏苡遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的薏苡遗传转化方法，其特征在于，步骤1的方法具体为：选择成熟健康的小白壳薏苡种仁，用自来水洗去表面的灰尘杂质，将其浸泡于10％次氯酸钠溶液中，在200rpm摇床摇动灭菌10min后倒掉废液并用超纯水洗去残留，接着加入75％酒精，同于摇床摇动灭菌，2min后洗净残留；将灭菌后的种仁浸泡于1％双氧水，在30℃的培养箱中放置3d，3d后幼芽长至0.5cm，在超净台中切下幼芽，将其培养在添加5mg/l 2,4-d和0.15mg/l 6-ba的ms培养基中，在25℃的暗培养条件下生长60d后，诱导出大量的胚性愈伤组织。
3.根据权利要求1所述的薏苡遗传转化方法，其特征在于，步骤2中，培养的具体方法为：在28℃的培养箱中倒置培养2～3d后，挑取单菌落至1ml相同浓度抗生素的yep液体培养基中，200rpm 28℃摇床过夜培养，菌液浑浊后，对菌液进行pcr扩增及电泳检测，确保质粒正确转入菌体。
4.根据权利要求1所述的薏苡遗传转化方法，其特征在于，步骤3中，还包括，向抗性培养基中加入农杆菌菌液，于200rpm 28...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭超，王景麟，杨雅文，周树峰，袁一冰，王雅南，李祥栋，高惠敏，雷红，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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