一种检测ADH2基因多态性的方法技术

本发明专利技术属生物技术领域，涉及一种检测ＡＤＨ２基因多态性的方法。本发明专利技术通过ＡＤＨ２基因及其多态相关碱基序列特征分析，用碱基错配创造酶切位点原理设计引物，其中一条引物根据突变位点邻近序列设计，引入错配碱基，使引物３’端和单碱基突变的一种突变型在ＰＣＲ扩增后形成一个酶切位点，然后用相应内切酶进行酶切鉴定。经实验验证引物设计合理，ＰＣＲ扩增顺利，扩增ＤＮＡ片段可被内切酶ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ和ＢｓｔＵＩ及其同工酶识别其多态类型，ＢＳＴＵＩ酶切后电泳图条带清晰，易于辨认，所用内切酶价格便宜，易获得，经测序验证，不同基因型序列特征与预期结果一致。经人群样本验证该方法稳定可靠。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，涉及一种ADH2基因多态性(rsl229984)检测方法。
技术介绍
研究报道，乙醇摄入人体后很快经口腔、食道、胃、肠等消化，其中肝脏是 其代谢最主要的器官，有90%-98%酒精在肝脏代谢。在正常情况下，低血浓度的 乙醇主要经ADH乙醇氧化体系代谢，长期饮酒时高浓度乙醇则主要经微粒体乙醇 氧化体系代谢。在ADH系统中的ADH2和ADH3存在基因多态现象，并表达不同 的酶活性，进而影响机体对乙醇的易感性，其中最主要是ADH2，所以出现不同 基因型的饮酒者对乙醇的敏感性，耐受性，酒后反应，饮酒行为等也有所不同， 且其基因型的不同与引发疾病密切相关，是目前国内外的一个研究热点。目 前ADH2多态检测方法主要包括聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术 (PCR-RFLP) 、等位基因特异PCR技术(AS-PCR)、 Taqman技术和对抗两对引 物PCR技术(PCR-CTPP) 等。现有技术均存在下述不足之处Taqman等技术所 需仪器和试剂花费巨大，通常为大型研究机构和公司使用；AS-PCR需两次PCR 反应造成样品和试剂用量增加，其使用的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染染色步骤繁 琐；PCR-CTPP方法应用中通过在引物的3'端区域引入一个人为不匹配碱基来提 高延伸反应的特异性，且其多重PCR反应的特殊性均可导致非特异条带和体系不 稳定等情况出现。经典的PCR-RFLP方法由于其操作简便，快速，终点判断准确而在基因多态 检测中最为常用，早期的ADH2基因多态检测中多用此方法，但其所需的MaeIH 来源稀少且价格不菲，从而在一定程度上限制了相关研究的开展。因此，建立一 种简便快速且经济的ADH2基因分型方法很有必要性。研究表明，在SNP无限制性酶切位点或者限制性内切酶价格昂贵的情况下， 可以通过设计包含酶切位点的错配引物来克服，即创造酶切位点法PCR (Created Restriction Site PCR， CRS-PCR)。其原理是根据单碱基突变位点的碱基替代情 况设计引物，其中一条引物根据突变位点邻近序列设计，人为引入错配碱基，使4得引物3'端和单碱基突变的一种突变型在PCR扩增后形成一个酶切位点，然后 应用相应的内切酶进行酶切鉴定。与本专利技术有关的现有技术的参考文献有1张竹梅,边建超.乙醇代谢酶基因多态与肿瘤关系研究进展.中华医学遗传学杂志，2001， 18(1): 62-652郭坤亮，季克良，王昌禄.酒精代谢及其相关基因遗传多态性.酿酒科 技，2005， 13(7): 36-383 曹西蓉，吴德生.AS-PCR在ADH2 、 ALDH2基因多态型分析中的应用.环 境与职业医学，2004， 21(5): 371-3734 SAIT0 K， Y0K0YAMA T, Y0SHIIKE N， et al. Do the ethanol metabolizing enzymes modify the relationship between alcohol consumption and blood pressure . Journal of Hypertension, 2003， 21 (6): 1097-11055 HI謹I A,證SUO K， WAKAI K, et al. Gene-gene and gene-environment interactions between alcohol drinking habit and polymorphisms in alcohol-metabolizing enzyme genes and the risk of head and neck cancer in Japan. Cancer Science, 2007， 98(7): 1087-10916 TAMAK0SHI A HNKHWKKNSTIHHKTTTK. Duplex polymerase chain reaction with confronting two-pair primers (PCR-CTPP) for genotyping alcohol dehydrogenase beta subunit (ADH2) and aldehyde dehydrogenase 2 (AU)H2) -Alcohol & Alcoholism, 2003， 38(5): 407-4107张忠彬，朱人,夏昭林.应用CRS-RFLP技术检测hOGGlc.326位点的单核苷酸多态性.中国工业医学杂志，2004， 17(5): 293-2958赵春江，李宁，邓学梅.应用创造酶切位点法检测单碱基突变.遗传，2003， 25(3): 327-329
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服现有技术存在的缺陷，提供一种检测ADH2基因多态 性(rsl229984)方法。本专利技术采用CRS方法设计适合的引物并选定廉价的内切酶进行PCR-RFLP多 态检测，即采用CRS-PCR-RFLP的检测方法对ADH2多态进行检测。本专利技术应用碱基错配创造酶切位点原理设计引物，设计一对创造酶切位点 引物扩增含多态的DNA片段，扩增后不同多态类型的DNA片段经限制性内切酶 Hhal、 HinPlI或者BstUI及其同工酶酶切后得电泳图谱，依据获得的电泳图谱条 带类型判断ADH2基因多态类型。本方法包括下述步骤1) 序列搜索与多态位点确定，确定ADH2多态位点为A/G多态rsl229984，位于第4染色体，第3外显子， 基因组位置3240;2) 序列分析与引物设计，上游Pl: 5， GGGATTAGTAGCAAMCCCTCAAATACA 3，下游P2: 5' CACTAACCfGAGGTCATCTGgi 3，3) PCR扩增和RFLP分析；4) 基因型的判断；5) ADH2基因多态结果鉴定。 本专利技术针对原有ADH2基因第3外显子3240位点多态(rsl229984) PCR-RFLP方法检测中内切酶价格昂贵且难以获得的缺点，应用碱基错配创造酶切位点原理 设计引物，设计一对创造酶切位点引物扩增含多态位点的DNA片段，扩增后不同 多态类型的DNA片段经限制性内切酶Hhal、HinPlI或BstUI酶切后能显示不同的电 泳图谱，依据条带类型可判断多态类型。引物设计后通过实验表明PCR扩增顺利， Bshl236I(BstUI的同工酶)酶切后电泳图谱条带清晰，易于辨认。本专利技术所采用 的限制性内切酶HhaI、 HinPlI和BstUI内切酶价格便宜，易于获得，可任选其一 进行酶切实验。经测序验证不同基因型序列特征，结果与预期完全一致。 附图说明图l是ADH2基因3240位点PCR产物经Bshl236I酶切后电泳图谱，其中，M:DNA分子量标准泳道1，2:AG; 泳道3:GG;泳道4: AA。 图2是ADH2基因3种多态测序图。具体实施方式 实施例11、序列搜索与多态位点确定6根据NCBI的GENE和SNP数据库，获取ADH2基因全序列及多态位点信息， 确定拟研究多态位点。所述的ADH2基因全序列和ADH2多态位点信息从下述网 页获得htt。:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/ent本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测ＡＤＨ２基因多态性的方法，其特征是应用碱基错配创造酶切位点原理设计引物，设计一对创造酶切位点引物扩增含多态的ＤＮＡ片段，扩增后不同多态类型的ＤＮＡ片段经限制性内切酶ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ或者ＢｓｔＵＩ及其同工酶酶切后得电泳图谱，依据获得的电泳图谱条带类型判断ＡＤＨ２基因多态类型。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：夏昭林，王威，焦洁，张忠彬，朱人，孙品，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]