一种癌症早期检测的微量cfDNA建库方法、试剂盒及应用技术

本发明专利技术提供一种适用于癌症早期检测的微量cfDNA建库方法，包括末端修复模块处理、接头连接模块处理、PCR标签模块处理和文库质检模块，原料组分简单，不需要复杂操作，重复性佳，对样本需求量少。本发明专利技术数据偏好性低，灵敏度和特异性高，可有效避免“误诊”和“漏诊”。本发明专利技术通过将血液cfDNA作为一种辅助癌症患者早期筛查的手段，可以作为影像学等的补充以解决现有技术诊断癌症敏感性不足的问题；利用本发明专利技术所述试剂盒经高通量测序后，能够有效检出单癌/泛癌早期患者基因水平变异信息，有效辨别癌症良性和恶性，并且发现使用1‑2ml血液即可达到10ml血液检测效果，从而减少采血量。

【技术实现步骤摘要】

技术介绍

1、cell-free dna(cfdna)是血浆游离核酸，由核小体断裂产生，包含肿瘤来源的序列，可作为生物标志物用于肿瘤用药指导和疗效评估、肿瘤复发监测，以及癌症早期筛查。然而，对cfdna进行检测在临床诊断应用中仍然存在挑战，cfdna在血液中含量较低，且以较短片段形式存在，缺少蛋白保护情况下易受化学损伤，半衰期较短。

2、液体活检技术在诊断中获得广泛应用，得益于传统影像学和组织活检的高成本和复杂性。cfdna中ctdna来源于肿瘤，但占比极低，此外，健康人序列与肿瘤序列相似度高，只有在高分辨率、高灵敏度以及大量标志物的情况下，才能获得准确的诊断信息。这些特征使得传统技术不能满足检测需求，二代测序技术兼具高通量和高灵敏度，结合不同的建库策略和生信分析流程，在检测方面凸显优势。

3、现有技术包括肿瘤标志物检测、肺癌等自身抗体检测、病毒检测、筛查金标准、易感基因检测和肿瘤基因检测。然而，现有技术的检测方法存在以下问题：灵敏度低，容易漏检；发病发现阶段迟，一般发现即为中晚期；影像学仪器设备检测具侵入性及辐射，费用高；易感基因检测只能解释遗传风险，尚无法预测当下患病状况，病灶的良性或恶性状态、临床分期及溯源病灶组织；肿瘤基因检测使用qpcr技术，通量低，且以单癌种筛查为主；ngs现有检测技术，对样本量要求高，需要10ml外周血或4-10ng cfdna才能进行检测。综上所述，癌症早期或微量样本面临无法有效准确检测的问题。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本专利技术提供一种适用于癌症早期检测的微量cfdna建库方法、试剂盒及应用。本专利技术所述基于ngs的检测试剂盒，组分简单，不需要复杂操作，重复性佳，对样本需求量少。本专利技术数据偏好性低，灵敏度和特异性高，可有效避免“误诊”和“漏诊”。本专利技术通过将血液cfdna作为一种辅助癌症患者早期筛查的手段，可以作为影像学等的补充以解决现有技术诊断癌症(胃癌/结直肠癌/乳腺癌/前列腺癌)敏感性不足的问题；利用本专利技术所述试剂盒经高通量测序后，能够有效检出单癌/泛癌(胃癌/结直肠癌/乳腺癌/前列腺癌)早期患者基因水平变异信息，有效辨别癌症良性和恶性，并且发现使用1-2ml血液即可达到10ml血液检测效果，从而减少采血量。

2、本专利技术的技术方案为：

3、一种适用于癌症早期检测的微量cfdna建库方法，包括末端修复模块处理、接头连接模块处理、pcr标签模块处理和测序与分析模块处理；

4、所述末端修复模块处理具体操作如下：

5、(a1)将cfdna样本吹打混匀3-5次，吸取1ng至pcr管中，用无核酸酶水补足体积至50ul；

6、(b1)将末端修复缓冲液解冻，末端修复酶混合物颠倒混匀，瞬时离心，置于冰上备用；

7、(c1)在cfdna pcr管中，按如下体积加入试剂：

8、

9、

10、(d1)吹打混匀20次，瞬时离心收集至管底；

11、(e1)将pcr管置于pcr仪中，进行下述反应，热盖105℃，20℃30min，65℃30min，4℃保存；

12、(f1)反应结束后，瞬时离心将反应液收集至管底，放置冰上，并立即进行下一步实验；

13、所述接头连接模块处理具体操作如下：

14、(a2)将连接缓冲液解冻，快速连接酶颠倒混匀，瞬时离心后将试剂置于冰上备用；dna接头原液稀释60倍；

15、(b2)在样本管中配制如下反应：

16、

17、(c2)吹打混匀20次，瞬时离心收集至管底；

18、(d2)将pcr管置于pcr仪中，进行下述反应，热盖105℃，20℃15min；

19、(e2)反应结束后，瞬时离心将反应液收集至管底，放置冰上；

20、(f2)使用dna磁珠对反应产物进行纯化；

21、所述pcr标签模块处理具体操作如下：

22、(a3)将pcr扩增引物预混液和高保真聚合酶预混液解冻后颠倒混匀，于灭菌pcr管中配制如下反应：

23、 组分 体积(ul) 上一步纯化产物 20 pcr扩增引物预混液 2.5-10 高保真聚合酶预混液 12.5-50 总计 50

24、(b3)吹打混匀20次，瞬时离心收集至管底；

25、(c3)将pcr管置于pcr仪中，进行下述反应：

26、

27、

28、(d3)反应结束后，瞬时离心将反应液收集至管底，放置冰上；

29、(e3)使用dna磁珠对反应产物进行纯化。

30、步骤(b1)中，所述末端修复缓冲液为1×的t4多聚核苷酸激酶缓冲液、20mm的atp、20mm的datp和2mm的dntp组成的混合物；或者1×的neb2缓冲液、20mm的atp、20mm的datp和2mm的dntp组成的混合物；

31、所述末端修复酶混合物为t4 pnk、taq dna聚合酶、klenow片段、dna聚合酶组成的混合物；或者，所述末端修复酶混合物为t4 pnk、taq dna聚合酶、klenow fragment exo-(无5’-3’外切酶活性)、dna聚合酶组成的混合物；

32、所述dna聚合酶为t4 dna聚合酶或bst dna聚合酶。

33、步骤(a2)中，所述连接缓冲液为10×t4 dna连接酶缓冲液和peg按照质量比1：1组成的混合物，所述peg为peg8000、peg6000、peg4000、peg2000中的一种或几种的混合物；

34、所述快速连接酶为t4 dna连接酶。

35、步骤(a2)中，所述接头为y接头、bubble接头、hairpin接头中的任一种。

36、步骤(a3)中，所述dna高保真聚合酶预混液为kapa hifi/phusion/la taq；

37、所述引物为带标签序列的引物。

38、步骤(f2)中和步骤(e3)中，所述磁珠溶液包括磁珠和缓冲液，所述磁珠为硅羟基或羧基修饰的磁珠。

39、所述磁珠的浓度为0.2-1mg/ml。

40、所述文库测序与分析模块本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种适用于癌症早期检测的微量cfDNA建库方法，其特征在于，包括末端修复模块处理、接头连接模块处理、PCR标签模块处理和测序与分析模块处理；

2.根据权利要求1所述的适用于癌症早期检测的微量cfDNA建库方法，其特征在于，步骤(B1)中，所述末端修复缓冲液为1×的T4多聚核苷酸激酶缓冲液、20mM的ATP、20mM的dATP和2mM的dNTP组成的混合物；或者1×的NEB2缓冲液、20mM的ATP、20mM的dATP和2mM的dNTP组成的混合物；

3.根据权利要求1所述的适用于癌症早期检测的微量cfDNA建库方法，其特征在于，步骤(A2)中，所述连接缓冲液为10×T4 DNA连接酶缓冲液和PEG按照质量比1：1组成的混合物，所述PEG为PEG8000、PEG6000、PEG4000、PEG2000中的一种或几种的混合物；

4.根据权利要求1所述的适用于癌症早期检测的微量cfDNA建库方法，其特征在于，步骤(A2)中，所述接头为Y接头、BUBBLE接头、Hairpin接头中的任一种。

5.根据权利要求1所述的适用于癌症早期检测的微量cfDNA建库方法，其特征在于，步骤(A3)中，所述DNA高保真聚合酶预混液为KAPA hifi/Phusion/LA Taq；

6.根据权利要求1所述的适用于癌症早期检测的微量cfDNA建库方法，其特征在于，步骤(F2)中和步骤(E3)中，所述磁珠溶液包括磁珠和缓冲液，所述磁珠为硅羟基或羧基修饰的磁珠。

7.根据权利要求6所述的适用于癌症早期检测的微量cfDNA建库方法，其特征在于，所述磁珠的浓度为0.2-1mg/ml。

8.根据权利要求1所述的适用于癌症早期检测的微量cfDNA建库方法，其特征在于，所述文库测序与分析模块处理中，使用Illumina或MGI二代测序平台，对文库进行测序及质控分析。

9.一种适用于癌症早期检测的微量cfDNA试剂盒，其特征在于，包括末端修复模块、接头连接模块、PCR标签模块和文库测序及分析模块。

10.根据权利要求1-8任一项方法构建的文库及权利要求9所述的试剂盒在癌症早期检测中的应用。

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【技术特征摘要】

1.一种适用于癌症早期检测的微量cfdna建库方法，其特征在于，包括末端修复模块处理、接头连接模块处理、pcr标签模块处理和测序与分析模块处理；

2.根据权利要求1所述的适用于癌症早期检测的微量cfdna建库方法，其特征在于，步骤(b1)中，所述末端修复缓冲液为1×的t4多聚核苷酸激酶缓冲液、20mm的atp、20mm的datp和2mm的dntp组成的混合物；或者1×的neb2缓冲液、20mm的atp、20mm的datp和2mm的dntp组成的混合物；

3.根据权利要求1所述的适用于癌症早期检测的微量cfdna建库方法，其特征在于，步骤(a2)中，所述连接缓冲液为10×t4 dna连接酶缓冲液和peg按照质量比1：1组成的混合物，所述peg为peg8000、peg6000、peg4000、peg2000中的一种或几种的混合物；

4.根据权利要求1所述的适用于癌症早期检测的微量cfdna建库方法，其特征在于，步骤(a2)中，所述接头为y接头、bubble接头、hairpin接头中的任一种。

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【专利技术属性】
技术研发人员：林子奥，阮婕，
申请(专利权)人：奥明星程杭州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：