一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种胶质芽孢杆菌的快速ＰＣＲ检测方法。包括如下步骤：１）配制菌体前处理缓冲液，其配方为：１０ｍｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ.Ｃｌ，１ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ，ｐＨ　８．０；２）样品预处理获得菌体；３）将菌体用菌体前处理缓冲液洗涤和悬浮，充分振荡混匀后，在沸水中温浴３－１０ｍｉｎ，经４℃、１２０００－１５０００ｒｐｍ离心１０－１５ｍｉｎ，上清即为ＤＮＡ样品，冰浴保存；４）以ＤＮＡ样品为模板，特异性ＰＣＲ扩增ｇｙｒＢ基因片段；５）ＰＣＲ扩增产物检测与分析。本发明专利技术应用特异性ＰＣＲ检测方法快速检测和鉴定胶质芽孢杆菌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法。
技术介绍
胶质芽孢杆菌(^a7/ws附7^0 ^)又称硅酸盐细菌，该菌普遍具有解钾、 固氮、解磷功能。我国从50年代开始对该菌进行大量应用研究，90年代开发成 微生物钾肥在全国大面积推广应用。目前，胶质芽孢杆菌作为重要的微生物钾 肥生产菌，广泛用于农业生产，有效促进了绿色农业的发展。近几年，胶质芽 孢杆菌在冶金、陶瓷、废水处理等热点领域的应用研究也倍受关注，如用于矿 石脱硅，有效提高矿石品质；作为添加剂，改善陶瓷性能；作为絮凝剂用于净 化废水、去除或富集重金属等。胶质芽孢杆菌制剂因安全、环保、易实现工业 化生产等优点，极具应用潜力。目前关于胶质芽孢杆菌的菌剂已又很多种，目前多用传统的分离培养方法对 该菌进行检测和鉴定。分离培养方法主要依据胶质芽孢杆菌的菌落特征，即透 明、凸起、玻璃样和粘度等，据研究具有相似形态特征的菌种还又其它种如土 壤芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌等，因此传统检测方法明显存在检测结果不可靠、 历时时间长、过程繁琐等缺点。可见，建立一种快速简便的胶质芽孢杆菌检测 方法对相关产品的检测及研究该菌在土壤中的生态学行为将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胶质芽孢杆菌的快速ＰＣＲ检测方法，其特征在于包括如下步骤：　１）配制菌体前处理缓冲液，其配方为：１０ｍｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ.Ｃｌ，１ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ，ｐＨ　８．０；　２）样品预处理获得菌体；　３）将菌体用菌体前处 理缓冲液洗涤和悬浮，菌体悬液在沸水中温浴３－１０ｍｉｎ后，经４℃、１２０００－１５０００ｒｐｍ离心１０－１５ｍｉｎ，上清即为ＤＮＡ样品，冰浴保存；　４）以ＤＮＡ样品为模板，特异性ＰＣＲ扩增ｇｙｒＢ基因片段；　５）ＰＣＲ扩增产物检 测与分析。

【技术特征摘要】
1.一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤1)配制菌体前处理缓冲液，其配方为10mmol/l Tris·Cl，1mmol/l EDTA，pH 8.0；2)样品预处理获得菌体；3)将菌体用菌体前处理缓冲液洗涤和悬浮，菌体悬液在沸水中温浴3-10min后，经4℃、12000-15000rpm离心10-15min，上清即为DNA样品，冰浴保存；4)以DNA样品为模板，特异性PCR扩增gyrB基因片段；5)PCR扩增产物检测与分析。2. 根据权利要求1所述的一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法，其特征 在于所述的样品预处理获得菌体步骤对于芽孢形态的微生物样品，将芽孢悬 浮于胶质芽孢杆菌的专用培养液中，28-3(TC温浴10-20min使芽孢萌发成菌体， 5000-10000rpm离心3-5min收集菌体。3. 根据权利要求1所述的一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法，其特征 在于所述的样品预处理获得菌体步骤对于微生物菌落样品，直接挑取菌落； 对于液体菌体样品，5000-10000rpm离心3-5min收集菌体。4. 根据权利要求1所述的一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法，其特征 在于所述的以DNA样品为模板，特异性PCR扩增gvrB基因片段步骤1) 特异性PCR扩增反应体系为20|il，包括10x缓冲液2^1， 0.3mmoH'1 的dNTP2 pi,浓度为0.1 pmoH的上游引物1 pl，浓度为0.1 pmoR1的下游引 物lpl， DNA样品l-2pl， Taq酶0.3-0.5U，去离子水ll.7-12.7pl;2) 特异性PCR扩增程序为94-95C预变性4-5 min， 94-95°(3变性30-60 s， 59-63。C复性30-60 s， 72。C延伸45-60 s，循环30-35次后，72。C延伸8-10 min。5. 根据权利要求4所述的一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法，其特征 在于所述的上游引物为F2: 5'-ACGGATATCTCCCAGACGTTCAT-3';下游引物 为R5: 5'國ACGGGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡秀芳，吴金光，方琼楼，陈集双，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]