一种快速富集N-乙酰葡萄糖胺修饰的肽段的方法技术

本发明专利技术涉及一种快速富集N‑乙酰葡萄糖胺修饰的肽段的方法，用GalNAz标记细胞后提取蛋白并酶解成肽段；肽段溶液与炔基树脂通过click反应连接，用不同的缓冲液洗涤炔基树脂上非特异吸附肽段；用胰蛋白酶切割释放肽段，收集样品进行LC‑MS/MS分析。炔基树脂是由含有一条作为linker的炔基肽段GGTENLYFQG(L‑aPra)与醛基树脂通过还原烷基化反应连接得到的，linker部分在胰蛋白酶酶切后产生裂解标签Tc‑tag共价键连接在糖肽的GlcNAc部分上，可用于质谱鉴定和肽段指认。本发明专利技术整个富集流程得到极大简化，且带上的标签质谱兼容，产生特定质量的氧鎓离子能帮助鉴定和指认O‑GlcNAc糖肽。此外，对于O‑GlcNAc这种低丰度修饰而言，该方法大大减少了富集过程中的样品损失，降低了需要的样品起始量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白质富集，尤其是涉及一种快速富集n-乙酰葡萄糖胺修饰的肽段的方法。

技术介绍

1、o-连接的β-d-n-乙酰氨基葡萄糖(o-glcnac)是最常见的糖基化修饰，可调节从转录和翻译到信号转导和新陈代谢等基本细胞过程。o-glcnac由两种酶控制，即o-glcnac转移酶(ogt)和o-glcnac酶(oga)，分别介导蛋白质中o-glcnac的添加和去除，以控制o-glcnacylation的动态循环。与磷酸化相似，蛋白上o-glcnac的可逆修饰会影响蛋白质的功能，并使其在生物过程中发挥重要的作用。在生理学上，越来越多的证据表明，o-glcnac平衡失调与糖尿病、神经退行性疾病和癌症等多种人类疾病的发病机制有关。因此，发现和鉴定o-glcnacylation以了解其在细胞生理和疾病中的功能一直是研究热点。

2、由于o-glcnacylation的丰度较低，且生物样本较为复杂，因此有必要在液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)分析o-glcnacylation之前开发富集方法。到目前为止，已经开发出一系列商业富集材料，如抗体、凝集素本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种快速富集N-乙酰葡萄糖胺修饰的肽段的方法，其特征在于，具体步骤包括：

2.根据权利要求1所述的一种快速富集N-乙酰葡萄糖胺修饰的肽段的方法，其特征在于，步骤1)中，用GalNAz标记细胞的方法为：

3.根据权利要求1所述的一种快速富集N-乙酰葡萄糖胺修饰的肽段的方法，其特征在于，步骤2)中，提取细胞核蛋白的方法如下：

4.根据权利要求3所述的一种快速富集N-乙酰葡萄糖胺修饰的肽段的方法，其特征在于，所述AS缓冲液的组成为30mM HEPES，pH＝7.4，15mM NaCl，350mM蔗糖，20μM Thiamet-G，1片/10mL不含EDT...

【技术特征摘要】

1.一种快速富集n-乙酰葡萄糖胺修饰的肽段的方法，其特征在于，具体步骤包括：

2.根据权利要求1所述的一种快速富集n-乙酰葡萄糖胺修饰的肽段的方法，其特征在于，步骤1)中，用galnaz标记细胞的方法为：

3.根据权利要求1所述的一种快速富集n-乙酰葡萄糖胺修饰的肽段的方法，其特征在于，步骤2)中，提取细胞核蛋白的方法如下：

4.根据权利要求3所述的一种快速富集n-乙酰葡萄糖胺修饰的肽段的方法，其特征在于，所述as缓冲液的组成为30mm hepes，ph＝7.4，15mm nacl，350mm蔗糖，20μm thiamet-g，1片/10ml不含edta的蛋白酶抑制剂；

5.根据权利要求3所述的一种快速富集n-乙酰葡萄糖胺修饰的肽段的方法，其特征在于，步骤2)中，核蛋白酶解的方法为：细胞核蛋白在75℃下加热15min后，用胰蛋白酶在37℃下消化过...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆豪杰，包慧敏，熊莹莹，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：