【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种自动化全定量拉曼分析方法。
技术介绍
1、传统的基于荧光的共焦成像和原位杂交根据特定标记进行亚细胞水平上生物分子可视化。然而，虽然有多种探针来标记特定的蛋白质和核酸序列，但其他类别的生物分子(包括碳水化合物、脂质和代谢物)通常更难以可视化。此外，由于所谓的色障，大多数依赖标签的技术只能同时研究样本中有限数量的目标。此外，生物分子的原位定量具有挑战性，只能以相对单位(例如平均荧光强度)间接进行。
2、荧光分析方法存在如下缺点：1.样品切片，荧光入射深度有限，只能对2d薄片进行分析。2.需要荧光染料进行标记，使用多种探针来标记特定的蛋白质和核酸序列。3.耗时长，需要进行细胞固定、透化、封闭、一抗孵化、二抗孵化、复染等处理步骤，通常需要12-48小时。4.大部分生物分子无法标记，多数生物分子不具有相对应的生物靶向标记位。5.
3、无法同时观测多种生物分子，由于固有的宽荧光光谱重叠，通常只能同时成像4–5种颜色。6.无法得到绝对含量，缺乏可靠的校准标准，只能根据平均荧光强度得到相对单位。
4、拉曼光谱成像是一种强有力的成像分析技术，它基于样品的拉曼光谱得到详细的化学信息分布图像。在图像的每一个像元上，都对应采集了一条完整的拉曼光谱，将这些光谱特征集成在一起，就产生了一幅反映材料的成分和结构的伪彩图像。其中共焦拉曼光谱成像无需样品制备即可对生物样本中的各种分子(包括碳水化合物、脂质、蛋白质、核酸、特定代谢物、药物和矿物质)进行高内涵、无标记、快速、3d可视化。然而，需要对解卷积光谱进行
5、现有拉曼光谱成像存在如下缺点：半定量方法，缺乏可靠的校准标准和标准化的预处理算法；全定量方法没有使用全谱分析，全定量受激拉曼局限于脂类和蛋白质大类的全定量分析，而全定量自发拉曼分析的区域为400-1800cm-1和2700-3100cm-1,由于很多药物的腈基化合物(c-n键)腈基化合物的拉曼特征峰都存在于1800-2700cm-1，该方法没有办法分析腈基化合物或者其他在拉曼沉默区中存在特征拉曼特征峰的物质。该方法还局限于7种生物标记物的分析，分别是蛋白质，饱和式脂肪酸，不饱和式脂肪酸，单一不饱和式脂肪酸，核酸，肝糖，细胞色素c，和4种在1800-2700cm-1没有特征峰的药物，分别为：胺碘酮、尼罗替尼、丙酸氟替卡松、来拉替尼。
6、现有的拉曼光谱处理方法，所有采集的拉曼光谱均在商用软件中按照每个像素的相同流程进行预处理：宇宙射线去除(典型地，滤波器尺寸：4；动态因子：4.1)，在瑞利区域设置最小值(-150-50cm-1)为零(检测器暗电流为零)，归一化设置主水峰平均值(3220-3420cm-1)等于1，使用基质空白(即在pbs中混合1％琼脂糖(w/v))，以及滚环基线校正(典型地，形状大小：300)以消除任何其他非特定背景信号伪影。最后，所有光谱均在400-3100cm-1范围内裁剪，同时忽略随后分离产生的生物“沉默区”(1800-2700cm-1)。
7、现有的分析方法全部把拉曼的“沉默区”截去，1800-2700cm-1的拉曼光谱没有展示也没有用来做数据分析，该方法能分析的药物种类非常有限，所有带有腈基化合物的药物都无法被分析。
8、现有的拉曼解谱算法，作为从拉曼光谱估计化学浓度的方法，带有一个隐含的假设：分析物的浓度与其相应的拉曼信号之间的关系必须是线性的。因此，混合物光谱被认为是每个组分拉曼指纹的理想加法，并按与其浓度直接相关的系数进行缩放。然而，在处理生化样品时，由于生物分子之间的相互作用，拉曼信号模式可能会发生微小变化，这可能会影响线性模型的准确性。为了解决这个问题，传统方法通过在不同浓度下包含化学混合物的校准集来解释这些潜在的影响。传统的拉曼解谱方法受限于校准集的覆盖范围、模型的线性假设简化、数据处理的复杂性、计算效率以及分析过程中的主观性，这些因素影响模型的准确性、泛化能力和自动化程度。
9、基线校正是拉曼光谱分析中至关重要的步骤，旨在去除光谱中的背景信号和噪声，以突显出目标物质的光谱特征。滚圆和滚环基线校正方法是其中的常用手段，通过拟合背景信号的形状并予以去除，从而提高光谱的信噪比和分辨率。然而，尽管这些方法在拉曼光谱分析中得到了广泛应用，滚圆和滚环基线校正方法有时无法完全贴合拉曼光谱中的每一个特征峰，导致处理后的光谱仍然存在噪声或失真。因此，对于追求更高精度和清晰度的研究来说，探索新的基线校正方法具有重要意义。
10、需要说明的是，在上述
技术介绍
部分公开的信息仅用于对本申请的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的在于克服上述
技术介绍
的缺陷，提供一种自动化全定量拉曼分析方法。
2、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、一种自动化全定量拉曼分析方法，包括以下步骤：
4、a)利用拉曼显微镜测量被测样品，获取其拉曼光谱数据；
5、b)对获取的拉曼光谱数据进行预处理，其中，消除非特定背景信号伪影，得到高清晰度和信噪比的拉曼光谱，同时保留1800-2700cm-1的生物“沉默区”(silent region)在内的整个拉曼光谱范围；
6、c)通过类似非负最小二乘回归的解谱算法对拉曼光谱进行解谱处理；
7、d)将每个输入拉曼光谱解谱为多种物质的纯物质子谱后，生成包含被分析物质2d分布与定量浓度分布信息的2d图片。
8、进一步地：
9、所述方法还包括：e)通过分层拍摄并逐层进行拉曼光谱测量，将所有2d图片重构成3d图片。
10、优选地，还可以包括：f)对被测样品进行多时间点位拉曼光谱分析，以实现4d拉曼成像。
11、所述解谱算法为有非负约束的线性最小二乘法，用于处理拉曼光谱数据并计算得到每种物质的含量，其中，求解如下最小化问题：
12、
13、其中，c为系数矩阵，其中每个元素代表对应每种纯物质的拉曼光谱，即为参考拉曼光谱，用于与样品光谱进行比较和匹配；x代表即每种物质的含量，包含了样品中不同物质对应的浓度或含量信息；d为样品的原始拉曼光谱数据；x≥0表示非负性约束，确保所有物质含量均为非负值；通过上述最小化问题求解得到的x作为每种物质含量的估计。
14、步骤b)具体包括：
15、(i)宇宙射线去除，通过分析每段的标准差来识别并磨平存在宇宙射线的区域；
16、(ii)将瑞利区域中的最小值设置为零，即通过找出整个拉曼光谱中的最小值并从所有数据中减去该最小值来设置探测器暗电流为零；
17、(iii)归一化处理，通过找出拉曼光谱3300-3400cm-1区域内的最小值并将其归一化为1来设置主水峰平均值；
18、(iv)消除非特定背景信号伪影。
19、步骤b)中，在宇宙射线去除过程中，通过设置本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种自动化全定量拉曼分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：e)通过分层拍摄并逐层进行拉曼光谱测量，将所有2D图片重构成3D图片；优选地，还可以包括：f)对被测样品进行多时间点位拉曼光谱分析，以实现4D拉曼成像。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述解谱算法为有非负约束的线性最小二乘法，用于处理拉曼光谱数据并计算得到每种物质的含量，其中，求解如下最小化问题：
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，步骤b)具体包括：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤b)中，在宇宙射线去除过程中，通过设置梯度阈值，优选阈值为8，以去除任何梯度大于该阈值的峰值；在归一化处理中，选择样本中含量最大的液体的拉曼光谱作为标准化的基准。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，步骤b)具体还包括：标准化和校正拉曼光谱，以消除实验中可能引入的任何非特定背景信号伪影；对生物分子单成分光谱进行浓度依赖性强度的定量分析，以评估不同生物分子的相对或
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于，应用于定量化学计量表型分析中，直接同时测量生物样本中/化学物质中任何能够提纯的物质的绝对浓度。
...【技术特征摘要】
1.一种自动化全定量拉曼分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：e)通过分层拍摄并逐层进行拉曼光谱测量，将所有2d图片重构成3d图片；优选地，还可以包括：f)对被测样品进行多时间点位拉曼光谱分析，以实现4d拉曼成像。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述解谱算法为有非负约束的线性最小二乘法，用于处理拉曼光谱数据并计算得到每种物质的含量，其中，求解如下最小化问题：
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，步骤b)具体包括：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤b)中，在宇宙射线去除过程中，通过设置梯度阈值，优选阈值为8，...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。