二鼠李糖脂人工抗原、抗体的制备和基于该抗体的酶联免疫试纸及其制备、检测方法技术

本发明专利技术公开了一种二鼠李糖脂人工抗原及抗体的制备，该人工抗原是以二鼠李糖脂为半抗原，以牛血清蛋白为载体，利用碳化二亚胺法将二者进行交联后制得；该抗体是用人工抗原免疫动物后分离抗血清制备得到。本发明专利技术还公开了一种酶联免疫试纸，其是以硝酸纤维素膜为载体，载体上的加样孔中附着二鼠李糖脂人工抗原，牛血清蛋白溶液封闭载体上剩余的蛋白质结合位点。通过将二鼠李糖脂稀释液与含有该抗体的抗血清混合预培育，然后滴加到试纸的加样孔中，通过竞争免疫反应后洗涤，酶联显色，根据酶联免疫试纸上斑点颜色深浅可确定出稀释液中二鼠李糖脂浓度大小。本发明专利技术的方法简便快捷，可低成本、大批量地检测，且检测结果的特异性高、可重复性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种表面活性剂的人工抗原、抗体的制备和基于该抗体的酶联免疫试纸及其制备、检测方法，尤其涉及一种鼠李糖脂类生物表面活性剂的人工抗原、抗体的制备和基于该抗体的酶联免疫试纸及其制备、检测方法。
技术介绍
生物表面活性剂是由微生物代谢过程中产生的一类表面活性剂，其疏水端与有机分子结合，亲水端与水结合，使水在有机物周围形成稳定的液膜，显著降低物质的表面张力，稳定乳化液和增加泡沫，与化学表面活性剂相比，具有高效、低毒和环境友好等特性，在环境、化工、医药和食品工业等领域得到了广泛的应用。生物表面活性剂能改变有机物在固/液相中的分配，增大微生物与有机物的接触面积，提高传质效率，为微生物本身提供良好的表面环境，从而刺激微生物的繁殖，使许多难降解的物质(如石油烃、有机农药以及多环芳烃等)得以顺利降解。 鼠李糖脂是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginose)发酵代谢产生的一种生物表面活性剂。铜绿假单胞菌在自然界分布广泛，为上壤中存在的最常见的细菌之一，也是堆肥等环境工程中普遍应用的一种有机物降解菌，其在堆肥过程中产生的鼠李糖脂能减少堆肥有机质表面水的表面张力，加强氧的传质效率，促进微生物胞外酶的分泌，显著改善堆肥过程中的微环境，加快有机污染物的降解。适量的鼠李糖脂还能结合重金属离子，形成鼠李糖脂-金属离子复合物。鼠李糖脂对微生物没有毒害作用，而且最终被微生物降解。因此，对鼠李糖脂产量进行快速定量分析，研究环境中鼠李糖脂的浓度与分布，对于监测微生物活性、改进生物表面活性剂以及促进微生物降解污染物的工艺具有重要意义。 目前，鼠李糖脂的定量分析方法主要包括分光光度法、界面张力仪(环法)、薄层层析法等方法，但这些方法往往容易受到复杂介质组分或者其他表面活性物质的干扰，而具有高精确度的色质联用法成本较高，需要配备大型仪器。免疫检测是利用动物体内抗原、抗体能发生特异性的吸附反应的性质来选择性识别具有免疫原性的待测物，在识别较大分子之间的微小差异方面具有很强的专一性，已被越来越多地用于分析从复杂的病毒、微生物、生物毒素到简单的农药分子、工业有机污染物、重金属离子等多种物质，成为环境中痕量物质检测方法的研究热点。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供了一种二鼠李糖脂人工抗原的制备方法以及利用该抗原制备二鼠李糖脂多克隆抗体的方法，在此基础上，本专利技术进一步提供了基于二鼠李糖脂多克隆抗体的酶联免疫试纸及该酶联免疫试纸的制备方法，通过该酶联免疫试纸及本专利技术提供的检测方法可以实现对生物表面活性剂二鼠李糖脂浓度的简便、快捷、低成本、大批量地检测，而且检测结果的特异性高、可重复性良好。 为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为一种二鼠李糖脂人工抗原的制备方法，包括以下步骤以二鼠李糖脂为半抗原，以牛血清蛋白(BSA)为人工抗原载体，利用碳化二亚胺(EDC)法将所述二鼠李糖脂与牛血清蛋白进行交联，所述碳化二亚胺、二鼠李糖脂和牛血清蛋白的质量比为1∶(5～7)∶(15～20)，交联完成后制得二鼠李糖脂人工抗原。自然界中的蛋白质等大分子经过一定方法纯化后即可直接作为免疫原制备抗体，而小分子量物质(分子量＜1000，如农药、重金属离子等)本身不具有诱导产生抗体的能力，必须与蛋白质载体偶联制备出人工抗原，才能再通过诱导得到相应抗体。偶联方法的选择因半抗原的结构而异，在本专利技术中，考虑到是以二鼠李糖脂作为半抗原，经过我们的反复实验及优化，将EDC、二鼠李糖脂、BSA三者以1∶(5～7)∶(15～20)的质量配比进行交联，成功制备出本专利技术的二鼠李糖脂人工抗原，冷冻干燥后，肉眼可见由BSA白色粉末变成了由细小结晶组成的白色晶体样物质(即二鼠李糖脂人工抗原)。 作为优选的技术方案，上述二鼠李糖脂人工抗原的制备方法具体包括以下步骤将所述5～7质量份的二鼠李糖脂、1质量份的碳化二亚胺溶解于N，N-二甲基甲酰胺和磷酸盐缓冲液(PBS)的混合液中，超声混合，然后将溶解有15～20质量份牛血清蛋白的PBS缓冲液添加到所述超声混合后的溶液中，在无光条件下进行搅拌，搅拌过程中通惰性气体保护，然后静置，再将静置后的溶液与生理盐水混合并反复进行透析，最后冷冻干燥得到二鼠李糖脂人工抗原。 作为一个总的技术构思，本专利技术还相应地提供一种二鼠李糖脂多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤将上述各制备方法制得的二鼠李糖脂人工抗原乳化，再免疫动物，然后利用免疫扩散方法测定该动物抗血清的效价，当效价达到1∶16以上的稀释倍数值时采血，分离抗血清，得到二鼠李糖脂多克隆抗体。 作为一个总的技术构思，本专利技术还提供一种基于上述的二鼠李糖脂多克隆抗体的酶联免疫试纸，所述酶联免疫试纸是以硝酸纤维素膜为载体，所述载体上设有一个以上的加样孔，每个加样孔(以通常4mm直径的加样孔计)中附着有0.24～0.5μg的上述制备方法制得的二鼠李糖脂人工抗原，所述加样孔周围的蛋白质结合位点附着有牛血清蛋白。 作为一个总的技术构思，本专利技术还相应提供一种上述酶联免疫试纸的制备方法，包括以下步骤以硝酸纤维素膜为载体，在所述载体上压印加样孔，用空白样本稀释液浸泡所述载体后干燥，然后在所述加样孔中固定所述的二鼠李糖脂人工抗原，再用牛血清蛋白溶液封闭所述载体上剩余的蛋白质结合位点，洗涤、干燥后制得酶联免疫试纸。 上述酶联免疫试纸的制备方法中，在所述加样孔中固定所述的二鼠李糖脂人工抗原优选是指在单个加样孔中滴加3～5μL浓度为80～100mg·L-1的二鼠李糖脂人工抗原溶液，再于35℃～40℃下干燥10～30min，完成固定。 上述酶联免疫试纸的制备方法中，用牛血清蛋白溶液封闭所述载体上剩余的蛋白质结合位点优选是指将固定有二鼠李糖脂人工抗原后的载体浸泡于质量浓度为1％～2％的牛血清蛋白溶液中，于35℃～40℃下孵育1～2h，完成封闭。 作为一个总的技术构思，本专利技术还相应提供一种上述酶联免疫试纸的检测方法，包括以下步骤将不同浓度的二鼠李糖脂样本稀释液分别与含有上述二鼠李糖脂多克隆抗体的抗血清混合预培育，将预培育后的混合液滴加到所述酶联免疫试纸的加样孔中，加样孔中固定的二鼠李糖脂人工抗原、待测二鼠李糖脂样本稀释液中的二鼠李糖脂和所述二鼠李糖脂多克隆抗体之间进行竞争免疫反应，反应完成后洗涤，酶联显色，根据所述酶联免疫试纸上斑点颜色深浅与所述二鼠李糖脂样本稀释液浓度的负相关特性，确定出二鼠李糖脂样本稀释液中的二鼠李糖脂浓度大小。采用本专利技术的酶联免疫试纸及检测方法，可以通过目测该试纸斑点上的颜色变化，测定铜绿假单胞菌发酵代谢产生的二鼠李糖脂浓度，操作简便易行，效果明显。 上述酶联免疫试纸的检测方法中，所述抗血清优选是指按1∶(500～600)的稀释度稀释后的抗血清，所述抗血清与二鼠李糖脂样本稀释液优选是等体积混合，所述混合预培育的时间优选为40～60min。通过实验发现，优选的抗血清稀释度能更好地保持其中抗体的反应活性，不至于因过量稀释而使抗体活性大大衰减，或者因稀释度不够使所述酶联免疫试纸对样本稀释液中的二鼠李糖脂的细微浓度变化不敏感。优选的预培育时间可以使样本稀释液中的二鼠李糖脂和抗血清中的抗体充分接触反应，并使样本稀释液中的微量二鼠李糖脂尽可能优先与抗体发生免疫结合。 上述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种二鼠李糖脂人工抗原的制备方法，包括以下步骤：以二鼠李糖脂为半抗原，以牛血清蛋白为人工抗原载体，利用碳化二亚胺法将所述二鼠李糖脂与牛血清蛋白进行交联，所述碳化二亚胺、二鼠李糖脂和牛血清蛋白的质量比为１∶（５～７）∶（１５～２０），交联完成后制得二鼠李糖脂人工抗原。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：汤琳，曾光明，李贞，章毅，黎媛萍，梁婕，龚继来，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]