一种从猪脾脏中提取转移因子的方法技术

本发明专利技术提供一种从动物脾脏中获取转移因子的方法，包括组织、高压均质机细胞破碎、絮凝剂沉淀、微孔滤膜过滤，超滤膜进行超滤等步骤。其中，破壁同时中加入了絮凝剂，使得溶液中的蛋白质沉淀，溶液变澄清，在超滤的过程中减少了堵塞中空纤维超滤柱的可能。本发明专利技术方法可大大缩短生产周期，节省了大量的人力物力，提高了转移因子的生产效率，为满足工业化大规模生产提供了可行途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽药领域，特别是涉及一种从动物脾脏中提取转移因子的 方法。本专利技术的
技术实现思路
主要涉及的是从猪脾脏中提取转移因子的方法。
技术介绍
转移因子(tmnsfer factor, TF)是T淋巴细胞释放的一种能够转移致 敏信息的物质，它能够特异地将供体的细胞免疫信息转移给受体，从而增 强受体的免疫功能。TF自50年代发现至今，国内外学者都对此进行大量 研究，并于1979年将其引入到兽医免疫和临床治疗中，目前其在国外已成 为一种应用广泛的增强免疫制剂。由于转移因子无种属特异性，因此临床上转移因子的来源较为广泛， 人类临床上常见的有人转移因子、猪转移因子、牛转移因子、羊转移因子、 鹅、猴转移因子等。目前畜禽上常见的有牛转移因子、猪转移因子，鸡转 移因子。禽畜脾脏为加工过程中的废物，因此有着极广的应用开发前景， 已成为转移因子研究的热点。转移因子为分子量小于10000，具有生物活性的非均一性的小分子混合 物，其内含物包括游离氨基酸(16-18种)，核酸、多肽及K、 Na、 Ca、 Mg、 Zn等金属元素。各种TF内的理化特性，组成成分差异不大，但含量有较 大差异。从免疫学上，TF可分为特异性转移因子和非特异性转移因子两大类。 特异性转移因子系采用某种特定病原感染或免疫人群、动物后再提取含该 抗原特异活性的转移因子，目前临床已经应用有乙型肝炎病毒特异转移因 子、各种肿瘤特异转移因子、流行性出血热病毒转移因子、布氏菌转移因子、疱疹病毒转移因子、乙型脑炎转移因子、结核菌转移因子等。非特异 性转移因子是指用自然人群或动物白细胞提取的具有多种免疫活性的转移 因子，可非特异性调节机体的免疫机能，从而提高机体的抵抗力或疫苗的 免疫效果。细胞免疫主要通过T淋巴细胞实现，王建文等报道转移因子能增强罗曼雏公鸡T淋巴细胞的比值，马风龙等研究发现将鸡脾脏转移因子与新城 疫I系苗同时给肉鸡注射可显著提高淋巴细胞的转化率，证明鸡脾脏TF对 鸡的细胞免疫有促进作用，可促进T淋巴细胞的增殖与成熟，增强机体的 细胞免疫应答能力。早期经典的转移因子机理研究试验就发现转移因子具有传递特异细胞 免疫信息的活性，而抗原信息的刺激与动物机体免疫功能的发挥有着直接 的联系。已有众多资料证实，转移因子可激活淋巴细胞E受体，增加E玫 瑰花结的形成数目。因此免疫信息通过TF转移给受体淋巴细胞，使细胞获 得这种免疫信息而产生识别特异性抗原的受体，当有该种抗原存在时，这 种特异性识别受体就会与特异性抗原结合而触发受体细胞活化，从增强淋 巴细胞的活性而导致其高度分化增殖。高迎春等研究报道鸡注射TF后，接种减蛋综合症灭活疫苗可以显著提 高鸡体的抗体滴度。马风龙等发现鸡TF活疫苗和油乳剂灭活苗在首免和加 强免疫时均具有协同作用，能显著提高免疫接种鸡的体液免疫应答能力， 产生较高滴度的抗体，并延长抗体高峰期，使之维持较小时间。由于X淋 巴细胞在实现体液免疫机能需要T淋巴细胞的辅助，目前普遍认为转移因 子对体液免疫的影响主要是通过T淋巴细胞调节机体的免疫机能。刘润珍等利用犬五联疫苗免疫猪后制备特异性脾脏转移因子，可以显 著增强小鼠E玫瑰花环形成率和腹腔巨噬细胞吞噬活性。陈德坤等研究发 现，给健康小鼠注射和口服猪脾脏转移因子可增强外周血液中性粒细胞对葡萄球菌的吞噬率和腹腔巨噬细胞对红细胞的吞噬率。因此，转移因子对 机体的非特异性免疫机能也有增强作用。范振青等研究发现，口服和注射TF可阻断由氢化可的松引起的小鼠的白细胞数、淋巴细胞百分率及脾重指数的下降。苗乃法采用环磷酰胺建立的免疫抑制家兔模型进行猪脾转移因子提升白细胞实验，注射后第3d即可 见白细胞总数迅速上升，第5d可达最高峰，第8d后趋向正常。由此推测TF 作为免疫激活剂进入机体后，可使造血系统在短时间内产生大量的白细胞， 同时活化淋巴细胞，增加T辅助细胞产生和释放更多的淋巴因子，促进T 淋巴细胞生长和分裂从而发挥抗放射、抗免疫抑制、增强免疫功能的作用。王建文等报道雏鸡口服0. 5-1. 0ML转移因子粗制品，7d后与未服用转 移因子组相比，增重明显，且口服转移因子组鸡精神活泼，羽毛有光泽。 江青艳等在试验中发现，注射脾脏转移因子对粤黄鸡增重有明显的效果。 动物机体的正常生长发育一般由T3、 T4和GH协同调控而完成。GH主要促 进组织生长，T3、 T4主要促进器官、组织的分化，而且，GH的促生长作用， 需要有适量的T3、 T4的存在。本试验中，注射不同浓度的TF鸡组在8周 龄时血液T4，GH水平均显著高于对照组，由此推断脾脏转移因子促进粤黄 鸡生长发育的内在机制与血液T4、 GH水平的升高有关。随着现代化养殖规模化、集约化程度的不断提高，目前病毒性疾病已 成为困扰养殖户的一大难题。现有的普遍的解决方法就是免疫，然而由于 种种原因，有时难免会造成免疫失败，爆发非典型性传染病，给诊断和治 疗带来一定困难。在免疫失败后往往依赖抗生素治疗，造成了耐药菌株的 增加和交叉感染的产生。转移因子作为一种细胞免疫发应增强剂，在防治 疾病方面可发挥重要的作用，提高免疫后的免疫效果，有效提高机体的抗 病能力。目前现有的转移因子技术，通常是将动物的脾脏中的脂肪和大血管剔出后，进行组织捣碎，反复冻融后，通过半透膜透析获得，操作费用高。另外，常规采用Laurence方法，即利用两次透析法回收转移因子此法操作简单，但生产周期长工序繁琐(生产周期约需要20天)，耗时长，浪费大量人力物力。因此这些方法都难以进行工业化大规模生产。因此，需要一种快速、高效并且经济的从动物脾脏中获取转移因子的方法，以满足目前的工业化生产。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种从动物脾脏中获取转移因子的方法，包括1) 将冷冻的动物脾脏1000g，用蒸馏水洗净后切成小块，加入1000ml蒸馏水，用组织捣碎机绞碎；2) 高压均质机(60MPa)进行细胞破碎，同时加入絮凝剂加入1%絮凝剂240ml;3) 在4。C下，以7000转/分，离心15分钟，去沉淀，留上清液；4) 上清液用微孔滤膜进行过滤，然后用超滤膜进行超滤，即为含有转移因子的原液。原液中含有预期的转移因子，然后按照国家药品管理办法去除病毒后配制。在一个具体实施方案中，所述的蒸馏水是去热原的蒸馏水。在另一个具体实施方案中，所述的絮凝剂是壳聚糖溶液。在另一个具体实施方案中，所述的微孔滤膜径优选0. 22 u m。在另一个具体实施方案中，所述的超滤膜优选截留分子量为5000道尔顿的超滤膜。在另一个具体实施方案中，所述的动物是畜类，优选猪。6术语"热原"系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物 质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热 原等。这里所指的"热原"，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产 物、细菌尸体及内毒素。致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次 是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能 产生热原。热原通常是磷脂多醇与蛋白质结合而成的复合物。磷脂多醇是 复合物的活性中心，致热作用最强。其化学组成因菌种不同而有所差异。分子量为5X104 5X105，分子量越大致热作用也越强。 去热原的方法包括1. 高温法热原的耐热性能良好，60。C加热lh本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从动物脾脏中获取转移因子的方法，包括：　１）将冷冻的动物脾脏１０００ｇ，用蒸馏水洗净后切成小块，加入１０００ｍｌ蒸馏水，用组织捣碎机绞碎；　２）高压均质机（６０ＭＰａ）进行细胞破碎，同时加入絮凝剂加入１％絮凝剂２４０ｍｌ；　 　３）在４℃下，以７０００转／分，离心１５分钟，去沉淀，留上清液；　４）上清液用微孔滤膜进行过滤，然后用超滤膜进行超滤，即为含有转移因子的原液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李旭东，苏建东，夏雪林，
申请(专利权)人：天津瑞普生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]