一种腺病毒末端反向重复序列的克隆方法技术

本发明专利技术公开了一种腺病毒末端反向重复序列的克隆方法，包括如下步骤：（1）基因组提取：采用经典方法提取腺病毒基因组DNA，并使用Nanodrop测定DNA浓度；（2）酶切消化；（3）去除末端蛋白；（4）复性处理；（5）环化连接；（6）PCR扩增；（7）克隆与测序：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收特定大小的DNA片段，并用TE缓冲液洗脱溶解，随后将片段克隆至pCE3‑blunt载体中，转化TOP10大肠杆菌，通过菌落PCR鉴定阳性克隆，并对阳性克隆进行测序。本发明专利技术提高了克隆效率，减少了操作步骤，增强了特异性，减少了错误克隆的可能性，扩大了应用范围，能够应对未知或新发的腺病毒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物，具体涉及一种腺病毒末端反向重复序列的克隆方法。

技术介绍

1、腺病毒科的病毒在从鱼类到人类的各种脊椎动物中广泛存在，病毒粒子是一类没有囊膜包裹的，直径约为90纳米的二十面体。腺病毒在各种生物中的发病能力不一，在婴儿或儿童中可以导致急性发热性咽喉炎，急性呼吸道疾病，肺炎等。在啮齿动物中，可以诱发犬传染性肝炎，可以导致幼犬丧命；鹿腺病毒被报道在加利福尼亚导致上千头鹿丧生；禽类腺病毒会导致禽类下蛋减少，诱发积水性心包炎综合症等疾病；腺病毒的基因组为双链dna，大小25-48kb，其末端含有反向重复序列（inverted terminal repeat, itr)，长度约为26-721个碱基。itr的5’末端通过化学键连接一个病毒编码的末端蛋白（precursorterminal protein，ptp）。末端蛋白的连接给腺病毒末端的反向重复序列克隆带来了一些困难。

2、目前，腺病毒末端反向重复序列itr的克隆方法主要有：

3、1)通过粘性末端内切酶如hindiii完全酶切后，dna片段用氢氧化钠孵育，去除末端蛋白后复性本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种腺病毒末端反向重复序列的克隆方法，其特征在于包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的腺病毒末端反向重复序列的克隆方法，其特征在于：在步骤（2）中，基因组的酶切消化，去末端蛋白和复性处理：吸取5-15微克的基因组DNA，加入平末端限制性内切酶，SmaI进行完全酶切后，加入异丙醇沉淀DNA片段，12000rpm离心10min，去上清，75%乙醇洗涤DNA沉淀2次，最后用90微升双蒸水溶解DNA片段。

3.根据权利要求1所述的腺病毒末端反向重复序列的克隆方法，其特征在于：在步骤（3）中，向步骤（2）的DNA中加入10微升1摩尔每升的氢氧化钠，孵育1小时，去除末端...

【技术特征摘要】

1.一种腺病毒末端反向重复序列的克隆方法，其特征在于包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的腺病毒末端反向重复序列的克隆方法，其特征在于：在步骤（2）中，基因组的酶切消化，去末端蛋白和复性处理：吸取5-15微克的基因组dna，加入平末端限制性内切酶，smai进行完全酶切后，加入异丙醇沉淀dna片段，12000rpm离心10min，去上清，75%乙醇洗涤dna沉淀2次，最后用90微升双蒸水溶解dna片段。

3.根据权利要求1所述的腺病毒末端反向重复序列的克隆方法，其特征在于：在步骤（3）中，向步骤（2）的dna中加入10微升1摩尔每升的氢氧化钠，孵育1小时，去除末端蛋白；然后加入5微升的2摩尔每升的盐酸来中和氢氧化钠，之后加入1摩尔每升的tris-hcl，调整缓冲体系至ph为8；然后加入2*ssc缓冲液116.66微升至...

【专利技术属性】
技术研发人员：占智高，李鹏，关丽梅，王金昌，杨健，陈俊晖，李江怀，
申请(专利权)人：江西省科学院微生物研究所江西省流域生态研究所，
类型：发明
国别省市：