偶联生物分子及其制备制造技术

通式（Ⅰ）的新型生物活性化合物，其中Ｘ和Ｘ′之一代表聚合物，另一个代表氢原子；每个Ｑ独立地代表连接基团；Ｗ代表吸电子基团或可由吸电子基团还原而得的基团；或者，如果Ｘ′代表聚合物，那么Ｘ－Ｑ－Ｗ－可以共同代表吸电子基团；另外，如果Ｘ代表聚合物，那么Ｘ′和吸电子基团Ｗ与居间的原子可以共同形成环；Ｚ↑［１］和Ｚ↑［２］各自独立地代表来源于生物分子的基团，每一个通过亲核基团连接到Ａ和Ｂ；或者Ｚ↑［１］和Ｚ↑［２］共同代表来源于生物分子的单一基团，通过两个亲核基团连接到Ａ和Ｂ；Ａ是Ｃ↓［１－５］亚烷基或亚烯基链；Ｂ是键或Ｃ↓［１－４］亚烷基或亚烯基链。上述生物活性化合物通过使合适的聚合物与合适的生物活性分子经由所述分子中的亲核基团、优选经由二硫桥偶联而形成。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】偶联生物分子及其制备
本专利技术涉及偶联生物分子以及由聚合物如聚乙二醇的新型化学官能化衍生物制备该偶联生物分子。
技术介绍
许多治疗活性分子不具有在临床医学应用上实现功效所需要的性质。例如，目前生物制药工业和遗传工程正在不断地发现和生产具有治疗活性的蛋白质和多肽。尽管目前在美国市场上存在至少80种蛋白质基药物，并且还有至少350种蛋白质基药物正在进行临床试验(Harris J，Chess R：Effect of Pegylation on pharmaceuticals.Nature Review Drug Discovery，2003，2，214-221)，但是大多数天然蛋白质并没有制出好药物，这是因为在向患者施用时存在几个固有缺陷，包括(1)蛋白质被存在于血液或组织中的许多内肽酶和外肽酶所消化，(2)许多蛋白质在一定程度上是免疫原性的，以及(3)蛋白质可以通过肾超滤作用被快速排泄。医药中用作活性治疗剂的、具有全身毒性或缺乏最佳生物利用度和药代动力学的其它分子包括有效剂量受到毒性限制的低分子量分子。这种分子常用于治疗由于癌变、感染和自身免疫疾病而导致的炎症和病症。水溶性的合成聚合物，尤其是聚亚烷基二醇，用于偶联治疗活性分子如蛋白质。已经表明，这些治疗偶联物通过延长循环时间和降低清除率来有利地改变药代动力学、降低全身性毒性，并在一些情况下表现出临床药效的提高。使聚乙二醇PEG共价偶联至蛋白质上的方法通常称作“聚乙二醇化(PEGylation)”，不过许多不同的聚合物也已被作为偶联聚合物进行研究。许多用于偶联的聚合物试剂包括水解不稳定的偶联化学官能团。水解不稳定的聚合物偶联剂的实例是活化酯，例如包括聚环氧烷-N-琥珀酰亚胺碳酸酯(Zalipsky美国专利No.5,122,614)。这些试剂在水性介质中具有较短的半寿期，所述水性介质包-->括血液或血浆。这导致需要加入化学计量上大量过量的偶联聚合物试剂。试剂的水解稳定性是重要的，因为对于蛋白质偶联加入化学计量上过量的要求需要大量的努力和成本，以从反应混合物中纯化聚合物-蛋白质偶联物。此外，这些水解不稳定的试剂倾向于优选与蛋白质中的胺化学官能团进行反应，尤其是赖氨酸残基的ε-胺。由于大多数相关的蛋白质具有多于一个赖氨酸残基，并经常具有许多赖氨酸残基，因此偶联倾向于在蛋白质上的许多残基位点上发生，而不是特异的。可以纯化偶联反应混合物以分离与一个聚合物分子偶联的蛋白质，但是不能以合理的成本分离全部与蛋白质上相同胺基偶联的聚合物-蛋白质偶联物。非特异偶联通常导致蛋白质功能的削弱。例如，通过赖氨酸残基随机结合聚环氧烷的抗体和抗体片段导致修饰型抗体(或修饰型抗体片段)能够以降低的亲和性、亲抗原性或特异性结合目标抗原。另外，胺特异性聚合物偶联剂需要选择确保蛋白质上的胺不被质子化的偶联反应条件。这些条件需要适当高pH的介质(8-10)，这使得胺基具有足够的活性与聚合物偶联剂反应。高pH条件通常对蛋白质是有害的，引起蛋白质的结构变化和变性。这些过程导致蛋白质功能的削弱。胺特异性聚合物偶联剂倾向于结合至蛋白质上可接近的胺位点。这些试剂可以称为动力学试剂(kinetic reagent)。它们是不稳定的，与蛋白质上最可接近的氨基亲核位点反应。通过胺酰化作用偶联的胺特异性聚合物偶联剂导致蛋白质上氨基酸残基的胺基团上正电荷的丢失，所述正电荷通常在生理条件下存在于未偶联蛋白质。胺特异性聚合物偶联剂的这些特征通常导致蛋白质功能的部分削弱。包含在聚合物中、用于偶联至蛋白质、胺特异性的并且通常水解不稳定的其他偶联功能基团包括异氰酸酯(WO 94/04193)和碳酸酯(WO 90/13540)。确保每个蛋白质上偶联聚合物分子的数目相同并且每个聚合物分子特异性地共价偶联至每个蛋白质分子中相同的氨基酸残基上，这对于最佳功效和确保剂量之间一致性来说是尤其相关的。沿着蛋白质分子上位点处的非特异性偶联导致偶联产物散布，并经常导致未偶联蛋白质而得到一种复杂混合物，要纯化所述复杂混合物是困难的、繁重的且昂贵的。已经开发了蛋白质的硫醇特异性聚合物偶联剂，它们致力于解决以下限制：与偶联至蛋白质的反应形成竞争的偶联剂水解反应的倾向性、蛋白质中不同氨基酸残基-->处的非特异性聚合物偶联和对高pH偶联反应条件的需要。可以在接近于中性的pH值时使用硫醇特异性聚合物偶联剂，此时蛋白质氨基酸残基上的胺官能基团被质子化，并因此不能在偶联反应中与聚合物偶联剂有效竞争。与前述胺特异性试剂相比，更加水解稳定的硫醇特异性聚合物偶联剂可以在较小的化学计量过量下使用，因此降低了聚合物-蛋白质偶联物纯化过程中的成本。对硫醇基团具有广泛选择性的偶联官能基团包括碘乙酰胺、马来酰亚胺(WO 92/16221)、乙烯砜(WO 95/13312和WO 95/34326)、乙烯基吡啶(WO 88/05433)以及丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯(WO99/01469)。这些硫醇选择性偶联基团在聚合物之间产生单一的硫醚偶联键。大多数蛋白质不具有自由巯基(sulfhydral)，因为这些巯基与蛋白质内的二硫桥进行重排和混杂(scrambling)反应，导致蛋白质功能削弱。对于具有自由巯基的蛋白质来说，这些巯基通常对于蛋白质功能而言是至关重要的。通常，在蛋白质中，巯基的数目少于胺基的数目(例如赖氨酸或组氨酸(histadine))。由于可以使得与蛋白质的偶联特异性发生在硫醇基团，并且由于蛋白质通常不具有自由的硫醇基团，因此存在通过突变引入用于结合PEG的硫醇位点而对蛋白质进行定点修饰的实例。但是，这种修饰大大增加了成本。所引入的自由巯基会具有上述工程蛋白质中蛋白质混杂和蛋白质二聚化的相似局限性。而且，例如，突变过程和由细菌源制备修饰蛋白质通常导致自由巯基被束缚在与谷胱甘肽的二硫键中。例如，白介素-2已经被突变修饰用半胱氨酸替换苏氨酸残基，从而使得可以进行PEG的位点特异性结合。[Goodson RJ，Katre NV；Bio/Technology(1990)8，343-346]。本领域中已知，偶联参数必须与相关治疗活性分子在聚合物形态、分子量特征、化学功能性方面进行最优匹配。尽管聚合物蛋白质偶联物可以表现出安全、有效的医药应用所需要的很多有利和必需的性质，但是聚合物偶联对于蛋白质活性和稳定性的影响对于性能来说是至关重要的。与偶联位置和数目相关的偶联变量以及聚合物特性必须与生物和物理化学性质最优相关。目前我们已经发现一系列新型试剂，它们可用于与来源于蛋白质中两个半胱氨酸残基的两个硫原子偶联以提供新型硫醚偶联物。首先本专利技术的目的是偶联形成天然蛋白质中天然二硫桥的两个硫原子。二硫键发现于医药相关的蛋白质中，具体是在-->分泌性蛋白、溶酶体蛋白和膜蛋白的胞浆外结构域。该技术提供了相对于将聚合物偶联至蛋白质的已知技术的明显优点。本专利技术提供具有下列通式的化合物其中，X和X′之一代表聚合物，另一个代表氢原子；每个Q独立地代表连接基团；W代表吸电子基团或可由吸电子基团还原而得的基团；或者，如果X′代表聚合物，那么X-Q-W-可以共同代表吸电子基团；另外，如果X代表聚合物，那么X′和吸电子基团W与居间原子可以共同形成环；Z1和Z2各自独立地代表来源于本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有下列通式的化合物，＊＊＊（Ⅰ）其中，Ｘ和Ｘ′之一代表聚合物，另一个代表氢原子；每个Ｑ独立地代表连接基团；Ｗ代表吸电子基团或可由吸电子基团还原而得的基团；或者，如果Ｘ′代表聚合物，那么Ｘ－Ｑ－Ｗ－可以共同代表吸电子基团；另外，如果Ｘ代表聚合物，那么Ｘ′和吸电子基团Ｗ与中间原子可以共同形成环；Ｚ↑［１］和Ｚ↑［２］各自独立地代表来源于生物分子的基团，每一个通过亲核基团连接到Ａ和Ｂ；或者Ｚ↑［１］和Ｚ↑［２］共同代表来源于生物分子的单一基团，通过两个亲核基团连接到Ａ和Ｂ；Ａ是Ｃ↓［１－５］亚烷基或亚烯基链；并且Ｂ是键或Ｃ↓［１－４］亚烷基或亚烯基链。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】GB 2003-7-11 0316294.81.具有下列通式的化合物，其中，X和X′之一代表聚合物，另一个代表氢原子；每个Q独立地代表连接基团；W代表吸电子基团或可由吸电子基团还原而得的基团；或者，如果X′代表聚合物，那么X-Q-W-可以共同代表吸电子基团；另外，如果X代表聚合物，那么X′和吸电子基团W与中间原子可以共同形成环；Z1和Z2各自独立地代表来源于生物分子的基团，每一个通过亲核基团连接到A和B；或者Z1和Z2共同代表来源于生物分子的单一基团，通过两个亲核基团连接到A和B；A是C1-5亚烷基或亚烯基链；并且B是键或Ci-4亚烷基或亚烯基链。2.权利要求1所述的化合物，其中聚合物X或X′是聚亚烷基二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚噁唑啉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酰胺、HPMA共聚物、聚酯、聚缩醛、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚亚氨基碳酸酯、聚酰胺、二乙烯基醚-马来酸酐或苯乙烯-马来酸酐的共聚物、多糖或聚谷氨酸。3.权利要求2所述的化合物，其中聚合物是聚乙二醇。4.权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中每个连接基团Q独立地代表直接键合、亚烷基或任选取代的芳基或杂芳基，其中任意一种都可以由一个或多个氧原子、硫原子、R代表烷基或芳基的-NR基团、酮基、-O-CO-基和/或-CO-O-基封端或中断。5.权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中W代表酮或醛基CO、酯基-O-CO-或砜基-SO2-，或由这种基团还原而得到的基团；或者X-Q-W-共同代表-->氰基。6.权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中Z1和Z2共同代表单一的生物分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：安东尼罗伯特戈德温，埃莉萨佩多内，崔志元，苏尼尔肖纳克，斯蒂芬詹姆斯布罗基尼，
申请(专利权)人：波利泰里克斯有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]