【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学，特别涉及一种干扰素腺病毒纳米囊泡及其作为载药递送系统的应用。
技术介绍
1、纳米囊泡(nanovesicles)通过使细胞反复通过微孔过滤器生成，细胞膜在这个过程中被撕碎，由于磷脂双分子层的疏水效应，这些碎片自发地重新组装成纳米大小的囊泡。细胞衍生的纳米囊泡能够包裹rna和蛋白质等来自母细胞的大部分生物活性物质，并具有相似的作用。目前携带有如蛋白质和rna等细胞信号分子的细胞外泌囊泡被认为参与细胞间通讯，其内容物可以在细胞间相互作用过程中递送至受体细胞，而具备相似结构和组分且更易得的纳米囊泡可以极大提高通讯效率。
2、间充质干细胞(mesenchymal stem cells,msc)是一种多能成体干细胞，其主要来源为骨髓及脂肪组织，脐带、胎盘、脑、皮肤等组织也能够分离，能够产生抗炎、抗凋亡的信号分子，具备对损伤组织微环境的免疫调节能力。但是干细胞直接应用的存活率有限导致效率不高，同时还存在着免疫排斥、细胞衰老和致瘤等风险，而将其以囊泡形式进行应用则可以避免这些风险，并且间充质干细胞的纳米囊泡产量是天然外泌囊泡的300倍左右，这使msc作为治疗用纳米囊泡生产载体具备极大优势。
3、msc衍生的纳米囊泡可以下调诱导型一氧化氮合酶(inos)等促炎酶，以及白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素6(il-6)和肿瘤坏死因子α(tnf-α)等炎性细胞因子，上调白细胞介素10(il-10)以及转化生长因子β(tgf-β)等抗炎细胞因子以减少伤口修复过程中的炎症。此外有研究表明，msc外泌体
4、基因递送技术是一种将外源遗传物质，如脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)等核酸分子，定点递送至靶细胞内并进行表达的技术。基因递送技术通过使用多种基因递送方式及基因递送载体，保护外源遗传物质在递送过程中的完整性，以实现外源遗传物质至靶目标的高效输送。由于病毒具备在宿主靶细胞中传递并且高效表达其遗传信息的天然特性，因此病毒载体是目前体内表达自身或外源蛋白的最有效的基因递送载体。常见的病毒载体包括腺病毒(adv)、腺相关病毒(aav)、慢病毒(lv)、水疱性口炎病毒(vsv)等。
5、机体对adv的温和免疫反应使其适合用于体内基因治疗，因此本专利技术选择腺病毒作为基因递送载体。目前adv已经是基因治疗的常见载体，用于治疗肺癌、胰腺癌、前列腺癌等各种癌症和囊性纤维化、黄斑变性等疾病。
6、纳米囊泡以及病毒载体均在细胞中进行生产并且与靶细胞相互作用，因此存在联合应用的可能性，共同发挥效力。溶瘤病毒纳米囊泡可以实现溶瘤病毒的高效转运和长期释放，囊泡通过内吞作用进入细胞后，溶瘤病毒成功从内体逃逸，在细胞内释放，从而将病毒基因转运到细胞核中，实现溶瘤病毒的高效递送。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种干扰素腺病毒纳米囊泡，通过筛选高效抗病毒干扰素亚型基因并插入至腺病毒基因组，使腺病毒携带干扰素被包裹进纳米囊泡，该腺病毒纳米囊泡解决了普通纳米囊泡对病毒性炎症缺乏针对性效果的问题。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种干扰素腺病毒纳米囊泡，将如seq id no.1所示的人干扰素ifn-α5核苷酸序列插入腺病毒基因组；由得到的腺病毒感染间充质干细胞，通过滤膜挤压后形成纳米囊泡，得到所述干扰素腺病毒纳米囊泡。
4、腺病毒载体存在联合msc进行药物递送的案例，但是应用仅局限于细胞本身，目前msc生产囊泡并未结合过腺病毒载体，而使用腺病毒载体生产msc来源纳米囊泡能够使纳米囊泡具有基因递送功能，进一步改进纳米囊泡治疗效果，将纳米囊泡作为载药递送系统发挥更丰富的效果。
5、病毒载体可以针对性表达目的基因发挥效力，而间充质干细胞则产生大量有益细胞因子，两者联合可以更好达到治疗效果，病毒载体增强了囊泡对于疾病的针对性，而间充质干细胞产物一定程度上减轻病毒载体可能诱发的炎症反应，较好弥补了彼此间的缺陷。
6、插入的人ifn-α5序列对hsv-1在体外具有显著抑制效果；腺病毒感染间充质干细胞使干扰素在间充质干细胞中过量表达。
7、本专利技术筛选出抗hsv-1复制干扰素亚型ifn-α5。该干扰素亚型为经筛选后对hsv-1体外复制抑制效果最显著的亚型。
8、一种本专利技术所述的干扰素腺病毒纳米囊泡的制备方法，该方法包括如下步骤：s1.腺病毒载体生产：
9、扩增如seq id no.1所示的人干扰素ifn-α5核苷酸序列，并将该序列插入腺病毒穿梭质粒的多克隆位点；将腺病毒骨架质粒及穿梭质粒共转染至hek-293a细胞中包装腺病毒；
10、s2.腺病毒囊泡制备：
11、超速离心浓缩s1得到的腺病毒使腺病毒tcid50超过10-8，使浓缩后的腺病毒感染间充质干细胞，感染后胰酶消化并收集细胞；
12、少量培养基重悬细胞后反复通过微孔滤膜，滤膜孔径逐步减小至0.22μm反复挤压细胞，使细胞的膜结构破碎成微小碎片，依靠磷脂双分子层的疏水效应形成纳米囊泡，得到干扰素腺病毒纳米囊泡。
13、作为优选，s1具体是：
14、扩增如seq id no.1所示的人干扰素ifn-α5序列，并通过同源重组方法将片段插入腺病毒穿梭质粒fv012多克隆位点中，插入成功则获取包装质粒fv012-ifn；
15、待6孔板内hek-293a细胞生长密度达到20-30％更换为2％血清浓度的dmem；分别在两个ep管中加入100μl dmem，其中一管加入2μg fv012/fv012-ifn以及6μl pei转染试剂，另一管加入6μg腺病毒骨架质粒pbhg以及18μl pei转染试剂，静置10分钟后将两管体系混合，再静置10分钟后缓慢滴加至含有细胞上清的6孔板中；转染8-12小时后更换2％血清浓度的dmem；持续培养7-15天，细胞样在-80℃冻融1次后12000rpm离心5分钟去除细胞碎片，将得到的初代腺病毒上清加入生长密度达到80％左右的hek-293a细胞中进行感染，感染时更换上清为无血清dmem，2小时后添加2％血清；
16、使用生长密度为80-90％的hek-293a细胞培养皿大量扩增表达干扰素的腺病毒，弃去原细胞培养上清，更换为无血清dmem并添加100μl转染所得的初代腺病毒上清，2小时后添加2％血清；约48小时后细胞贴壁能力下降大量脱落，在-80℃冻融3次后12000rpm本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种干扰素腺病毒纳米囊泡，其特征在于：将如SEQ ID No.1所示的人干扰素IFN-α5核苷酸序列插入腺病毒基因组；
2.一种权利要求1所述的干扰素腺病毒纳米囊泡的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于S1具体是：
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于S2具体是：
5.一种权利要求1所述的干扰素腺病毒纳米囊泡作为载药递送系统的应用。
6.一种权利要求1所述的干扰素腺病毒纳米囊泡在制备角膜炎药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种干扰素腺病毒纳米囊泡，其特征在于：将如seq id no.1所示的人干扰素ifn-α5核苷酸序列插入腺病毒基因组；
2.一种权利要求1所述的干扰素腺病毒纳米囊泡的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
3.根据权利要求1所述的制备...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。