条件性表达PE2的细胞系建立及其应用制造技术

本发明专利技术公开了条件性表达PE2的细胞系建立及其应用。将pCW‑PE2载体与慢病毒包装相关载体(pMD2G，psPAX)共转入293T细胞制备病毒悬液。然后将病毒悬液感染到PK15细胞系，在添加强力霉素(Dox)的条件下诱导培养72h后，利用嘌呤霉素进行药筛，最后得到存活的PK15细胞，利用免疫荧光检测其阳性率。本发明专利技术所述的条件性表达PE2的PK15细胞系(以下简称PE2‑PK15)，可以在含有Dox的条件下诱导PE2表达，反之则不表达。PE2‑PK15细胞系在进行PE编辑的时候，只需要将pegRNA转入细胞即可达到实验目的。同时，本发明专利技术可以极大简化PEs编辑实验流程，提高定点编辑效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程，涉及条件性表达pe2的细胞系及其应用。

技术介绍

1、早期的crispr/cas9基因编辑及其衍生技术不能实现任意碱基的颠换，且进行多位点共编辑的效率和精准度较低。2019年，david liu研究员等在nature上报道了引导编辑(prime editors,pes)系统，该团队将莫洛尼鼠白血病毒逆转录酶(m-mlv rt)融合到ncas9的c末端得到第一代引导编辑器(pe1)，但编辑效率极低，为提高pes的编辑活性，该团队通过构建不同m-mlv rt酶突变体，获得编辑效率高的pe2系统[1]。

2、该技术自开发以来展现了其巨大的运用前景，pes系统已被成功运用于多种哺乳动物(人、小鼠和兔等)以及水稻和小麦等重要农作物的基因组编辑[2-4]。如高彩霞研究员团队利用pe系统，在水稻和小麦获得引导编辑的成功[4]。西北农林科技大学王小龙教授课题组利用pes系统首次获得小鼠疾病模型[3]。最近研究表明，pes系统在猪物种上编辑效率极低，平均只有1％不到的编辑效率[4]。再者，pes系统编辑效率存在不稳定性，受细胞类型、peg本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种构建条件表达Cas9变体和逆转录酶融合蛋白的载体pCW-PE2的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.按照权利要求1所述的方法构建的条件表达Cas9变体和逆转录酶融合蛋白的载体pCW-PE2。

3.权利要求2所述的载体pCW-PE2在构建条件性表达PE2的细胞系中的应用。

4.一种构建条件性表达PE2的细胞系的方法，其特征在于包括将权利要求3所述的载体pCW-PE2与慢病毒包装相关载体共转入293T细胞制备病毒原液，然后将病毒原液感染到PK15细胞系，添加强力霉素Dox诱导培养64-75h后，利用嘌呤霉素进行药筛，最后得到存活的PK15细胞，即...

【技术特征摘要】

1.一种构建条件表达cas9变体和逆转录酶融合蛋白的载体pcw-pe2的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.按照权利要求1所述的方法构建的条件表达cas9变体和逆转录酶融合蛋白的载体pcw-pe2。

3.权利要求2所述的载体pcw-pe2在构建条件性表达pe2的细胞系中的应用。

4.一种构建条件性表达pe2的细胞系的方法，其特征在于包括将权利要求3所述的载体pcw-pe2与慢病毒包装相关载体共转入293t细胞制备病毒原液，然后将病毒原液感染到pk15细胞系，添加强力霉素dox诱导培养64-75h后，利用嘌呤霉素进行药筛，最后得到存活的pk15细胞，即为条件性表达pe2的细胞系。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的慢病毒包装相关载体为pmd2g和pspax2。

6.根据权利要求5所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯黎明，肖伟，刘红林，赵冠凯，李韬，黄瑞华，李平华，赵清波，周五朵，张倩，谢袖梅，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：