【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞培养，具体涉及一种利用外周血大量扩增nk细胞的方法。
技术介绍
1、肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的异常组织，是现代社会中对人类威胁最大的疾病之一，对肿瘤的治疗一直是现代医学的关注点。癌症具有细胞分化和增值异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征，其发生是一个多因子、多步骤的复杂过程，分为致癌、促癌、演进三个过程，与吸烟、感染、职业暴露、环境污染、不合理膳食、遗传因素密切相关。
2、近年来，自然杀伤细胞(natural killer cell，nk)免疫治疗技术在世界范围内正在成为一种可靠的抗癌疗法，适用于多种恶性肿瘤的临床治疗且副作用小，不损伤正常组织。nk细胞(natural killer cell)是一类天然具有杀伤肿瘤细胞作用的免疫细胞，属于淋巴细胞谱系，含有穿孔蛋白和粒酶颗粒的细胞毒淋巴细胞。其对靶细胞的识mc限制性，无需预先致敏即可直接杀伤肿瘤细胞，在先天性免疫和适应性免疫反应中都发挥着关键的作用，能够抵御由病毒感染或者恶性肿瘤引起的异常细胞，是机体抵抗恶性肿瘤和病毒感染的重要免疫调节细胞。然而nk细胞仅占外周血单个核细胞的5-20％，并且还会受人体内环境的影响，降低其数量和活性。
3、nk细胞的肿瘤杀伤机制包括：
4、穿孔素和颗粒酶介导细胞毒性作用；
5、衰亡受体介导的靶细胞凋亡；
6、nk细胞表面表达的cd16分子与肿瘤特异性结合，杀死肿瘤细胞；
7、抗体依赖细胞毒性作用。
8、目
9、因此，目前研究出一种高效、扩增速率快以及细胞活率、纯度高的nk细胞培养技术对于临床研究具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种利用外周血大量扩增nk细胞的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种利用外周血大量扩增nk细胞的方法，包括以下步骤：s1：从人外周血中分离单个核细胞；
3、s2：用nk细胞激活培养基a培养，将外周血单个核细胞接种在预包被的培养瓶中共同培养；
4、s3：培养至第三天加入一定量的nk细胞激活培养基a,使最终的细胞密度与步骤s2中的将细胞密度保持一样，然后静置培养，第7天之后每隔一天加入nk细胞扩增培养基b；
5、s4：培养至第13-15天，获取高纯度nk细胞。
6、优选的，所分离的单个核细胞均来自于健康的人的外周血；步骤s1还包括：s11：外周血转入离心管中700g离心10min，吸取上层部分血浆获得自体血浆，56℃灭活30min后，900g离心10min备用；
7、s12：取15m1淋巴分离液加入50m1离心管中，将稀释后的血液缓慢加到分离液上层，900g离心20分钟，升降速调到最低；
8、s13：吸出离心后的白膜层，用生理盐水重悬细胞，700g离心10min，倒掉上清后重复步骤，500g离心8min，离心沉淀，即为外周血单个核细胞。
9、优选的，所述nk细胞激活培养基a中含有il-2、il-12、il-15、il-18、il-27、ok432、chir99021、烟酰胺、抗坏血酸、重组人干扰素γ、5％的自体血浆以及淋巴细胞培养基。
10、优选的，每次添加nk细胞激活培养基a，都将细胞密度调整为1.0-2.0×106个/m1。
11、优选的，步骤s2中，在接种单个核细胞的步骤之前，还包括用cd3、cd16、cd126、cd137、nkp46、2b4和10m1 dpbs缓冲液包被培养瓶的预处理过程；预包被用的cd3和cd16的浓度为10ug/m1、cd126和cd137的浓度为10ng/m1、nkp462的浓度为65ng/m1、2b4的浓度为0.5ug/m1。
12、优选的，步骤s2-s3中，il-2的浓度为1000iu/m1、il-12的浓度为20ng/m1、il-15的浓度为20ng/m1、il-18的浓度为25ng/m1、il-27的浓度为25ng/m1、抗坏血酸的浓度为20ug/m1、ok432的浓度为0.06ke/m1、chir99021的浓度为5um、烟酰胺的浓度为5mm、重组人干扰素γ的浓度为1000iu/m1、自体血浆的浓度为5％。
13、优选的，所述nk细胞扩增培养基b包括1000iu/m1的il-2、5％的自体血浆以及淋巴细胞培养基。
14、优选的，所述淋巴细胞培养基为x-vivo培养基、aim-v培养基、gt-551-h3培养基中的任意一种；自体血浆所占百分比是自体血浆占需要添加培养基的体积百分比。
15、优选的，步骤s2-s4中，nk细胞均在37℃、5％co2培养箱中静置培养。
16、优选的，包被培养瓶需要在4℃环境下过夜。
17、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术的方法中，在培养液中添加的il-2、il-12、il-15、il-18、重组人干扰素γ，提高细胞因子对nk细胞的刺激，激活nk细胞，高浓度的il-2能有效抑制t细胞的生长，提高细胞纯度；cd3、cd16、nkp46等在初期加入也能激活nk细胞，促使细胞增殖；添加的烟酰胺能够增强nk细胞增值能力和毒活性；chir99021可以激活生物体的免疫应答，诱导nk细胞的生长活化；同时添加了抗坏血酸，能够显著降低细胞的死亡，使细胞的成活率可达95％以上；本专利技术方法操作简单、速度快、纯度高，杀伤力强，可实现nk细胞的高效快速扩增。
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1.一种利用外周血大量扩增NK细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种利用外周血大量扩增NK细胞的方法，其特征在于：所分离的单个核细胞均来自于健康的人的外周血；步骤S1还包括：S11：外周血转入离心管中700g离心10min，吸取上层部分血浆获得自体血浆，56℃灭活30min后，900g离心10min备用；
3.根据权利要求1所述的一种利用外周血大量扩增NK细胞的方法，其特征在于：所述NK细胞激活培养基A中含有IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-27、OK432、CHIR99021、烟酰胺、抗坏血酸、重组人干扰素γ、5％的自体血浆以及淋巴细胞培养基。
4.根据权利要求1所述的一种利用外周血大量扩增NK细胞的方法，其特征在于：步骤S2-S3中，每次添加NK细胞激活培养基A，都将细胞密度调整为1.0-2.0×106个/m1。
5.根据权利要求1所述的一种利用外周血大量扩增NK细胞的方法，其特征在于：步骤S2中，在接种单个核细胞的步骤之前，还包括用CD3、CD16、CD126、CD137、NKP
6.根据权利要求3所述的一种利用外周血大量扩增NK细胞的方法，其特征在于：步骤S2-S3中，IL-2的浓度为1000IU/m1、IL-12的浓度为20ng/m1、IL-15的浓度为20ng/m1、IL-18的浓度为25ng/m1、IL-27的浓度为25ng/m1、抗坏血酸的浓度为20ug/m1、OK432的浓度为0.06KE/m1、CHIR99021的浓度为5uM、烟酰胺的浓度为5mM、重组人干扰素γ的浓度为1000IU/m1、自体血浆的浓度为5％。
7.根据权利要求1所述的一种利用外周血大量扩增NK细胞的方法，其特征在于：所述NK细胞扩增培养基B包括1000IU/m1的IL-2、5％的自体血浆以及淋巴细胞培养基。
8.根据权利要求3或7所述的一种利用外周血大量扩增NK细胞的方法，其特征在于：所述淋巴细胞培养基为X-VIVO培养基、AIM-V培养基、GT-551-H3培养基中的任意一种；自体血浆所占百分比是自体血浆占需要添加培养基的体积百分比。
9.根据权利要求1所述的一种利用外周血大量扩增NK细胞的方法，其特征在于：步骤S2-S4中，NK细胞均在37℃、5％CO2培养箱中静置培养。
10.根据权利要求5所述的一种利用外周血大量扩增NK细胞的方法，其特征在于：包被培养瓶需要在4℃环境下过夜。
...【技术特征摘要】
1.一种利用外周血大量扩增nk细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种利用外周血大量扩增nk细胞的方法，其特征在于：所分离的单个核细胞均来自于健康的人的外周血；步骤s1还包括：s11：外周血转入离心管中700g离心10min，吸取上层部分血浆获得自体血浆，56℃灭活30min后，900g离心10min备用；
3.根据权利要求1所述的一种利用外周血大量扩增nk细胞的方法，其特征在于：所述nk细胞激活培养基a中含有il-2、il-12、il-15、il-18、il-27、ok432、chir99021、烟酰胺、抗坏血酸、重组人干扰素γ、5％的自体血浆以及淋巴细胞培养基。
4.根据权利要求1所述的一种利用外周血大量扩增nk细胞的方法，其特征在于：步骤s2-s3中，每次添加nk细胞激活培养基a，都将细胞密度调整为1.0-2.0×106个/m1。
5.根据权利要求1所述的一种利用外周血大量扩增nk细胞的方法，其特征在于：步骤s2中，在接种单个核细胞的步骤之前，还包括用cd3、cd16、cd126、cd137、nkp46、2b4和10m1dpbs缓冲液包被培养瓶的预处理过程；预包被用的cd3和cd16的浓度为10ug/m1、cd126和cd137的浓度为10ng/m1、nkp462的浓度为65ng/m1、2b4的...
【专利技术属性】
技术研发人员：马啸晨，许亮，
申请(专利权)人：陕西领阅康成生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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